分子生物学实验技术大全
1. 基因组 DNA 提取 .................................................................................................................................91.1. 酵母、细菌基因组 DNA 提取..................................................................................................................... 9
1.2. 真核细胞 DNA 的制备与定量..................................................................................................................... 9
1.3. DNA 片段回收与纯化----冻融法..............................................................................................................11
1.4. 琼脂糖凝胶的特点.......................................................................................................................................11
1.5. 琼脂糖核酸电泳.......................................................................................................................................... 13
2. 聚合酶链式反应（PCR）...................................................................................................................14
2.1. PCR 概述..................................................................................................................................................... 14
2.2. PCR 引物设计黄金法则............................................................................................................................. 17
2.3. PCR 反应体系............................................................................................................................................. 18
2.4. PCR 反应的重要因素................................................................................................................................. 19
2.5. PCR 反应条件的选择................................................................................................................................. 20
2.6. PCR 常见问题总汇..................................................................................................................................... 22
2.7. 减少 PCR 产物中引物二聚体的方法 ........................................................................................................ 23
2.8. pfu 特性 FAQ............................................................................................................................................. 24
2.9. 增加 PCR 特异性的方法............................................................................................................................ 26
2.10. 反向 PCR（染色体步移）......................................................................................................................... 28
2.11. PCR 污染与对策......................................................................................................................................... 29
2.12. PCR 产物纯化方法（酚/氯仿） ............................................................................................................... 32
2.13. 大肠杆菌菌落 PCR..................................................................................................................................... 32
2.14. 酵母菌落 PCR............................................................................................................................................. 33
2.15. 胶回收纯化 DNA........................................................................................................................................ 33
2.16. PCR 技术片段拼接的 SOE 和 SDL 方法.................................................................................................. 34
2.17. SOE-PCR，Fusion-PCR FAQ................................................................................................................ 34
2.18. 聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP).............................................................................. 39
2.19. 用 Fusion PCR 构建基因片段.................................................................................................................. 42
3. 载体 DNA 的提取、鉴定与相关操作................................................................................................43
3.1. 质粒概述...................................................................................................................................................... 43
3.2. 质粒快速鉴定.............................................................................................................................................. 45
3.3. 质粒 DNA 的小量制备（20 μl）............................................................................................................. 45
3.4. 质粒 DNA 的大量制备（3 mL）............................................................................................................. 48
3.5. λ噬菌体 DNA 提取.................................................................................................................................... 49
3.6. 酶切.............................................................................................................................................................. 50
3.7. 单酶切.......................................................................................................................................................... 51
3.8. 单酶切方向问题：注意！ .......................................................................................................................... 52
3.9. 双酶切.......................................................................................................................................................... 52
3.10. KpnI+BamHI............................................................................................................................................ 53
3.11. XbaI+BamHI ............................................................................................................................................ 53
3.12. 连接.............................................................................................................................................................. 54
3.13. 酶切产物的乙醇沉淀方法 .......................................................................................................................... 54
4. TA 克隆、亚克隆、克隆相关.............................................................................................................55
4.1. 目的基因的亚克隆...................................................................................................................................... 55
4.2. T4 DNA 连接酶 FAQ................................................................................................................................ 57
4.3. PCR 产物的克隆......................................................................................................................................... 59
4.4. 外源 DNA 和质粒载体的连接反应........................................................................................................... 60
5
4.5. 克隆 PCR 产物 FAQ................................................................................................................................... 62
4.6. 连接反应心得.............................................................................................................................................. 63
4.7. DNA 重组实验............................................................................................................................................ 65
4.8. pfu 的 PCR 产物加 A 尾巴以便于 T 载体连接及 pMD-18T 连接体系............................................... 67
5. 感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选与鉴定............................................................................68
5.1. 大肠杆菌化学法感受态细胞的制备及转化............................................................................................... 68
5.2. 大肠杆菌化学法高效率感受态细胞的制备（详细的）........................................................................... 69
5.3. 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备及转化............................................................................................... 70
5.4. 重组子的筛选和鉴定.................................................................................................................................. 71
5.5. 酵母电转化感受态细胞制备及转化........................................................................................................... 72
5.6. 不带抗性的酵母营养缺陷型的富集与筛选............................................................................................... 73
5.7. 毕赤酵母电转化方法.................................................................................................................................. 73
5.8. 电击杯处理.................................................................................................................................................. 74
5.9. 真核转染...................................................................................................................................................... 75
5.10. PDS-1000 基因枪操作手册..................................................................................................................... 77
6. 基因敲除、定点突变，与定向进化 ...................................................................................................78
6.1. 一种可重复利用的酵母基因敲除方法....................................................................................................... 78
6.2. 自杀质粒...................................................................................................................................................... 80
6.3. 基于 DpnI 的定点突变方法....................................................................................................................... 81
6.4. 基于 PCR 的定点突变实例........................................................................................................................ 82
7. 核酸与蛋白质杂交技术.......................................................................................................................82
7.1. Southern 杂交（一）.............................................................................................................................. 82
7.2. Southern 杂交（二）............................................................................................................................... 85
7.3. Northern 杂交（一）............................................................................................................................... 86
7.4. Northern 杂交（二）............................................................................................................................... 88
7.5. Western 杂交（一） ................................................................................................................................ 90
7.6. Western 杂交（二） ................................................................................................................................ 91
7.7. 抗体制备技术的选择.................................................................................................................................. 95
7.8. 原位杂交技术简介...................................................................................................................................... 98
7.9. 原位杂交组织化学常用试剂及处理......................................................................................................... 102
7.10. 荧光原位杂交（FISH）............................................................................................................................114
8. 酵母双杂交技术.................................................................................................................................116
8.1. 酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用......................................................................................116
8.2. 酵母双杂交系统的发展和应用 .................................................................................................................119
8.3. LexA 酵母双杂交系统操作方法.............................................................................................................. 121
8.4. 酵母双杂交系统的建立与发展 ................................................................................................................ 132
8.5. 酵母双杂交系统研究及其应用 ................................................................................................................ 133
8.6. 酵母双杂交实验 FAQ............................................................................................................................... 136
9. RNA 136
9.1. RNA 操作中的一般要求.......................................................................................................................... 136
9.2. 蛋白酶 K 替代 DEPC 的系统方法........................................................................................................... 137
9.3. 总 RNA 的提取（Trizol 法提取） ......................................................................................................... 137
9.4. 一种快速鉴定 RNA 质量的方法 ............................................................................................................ 137
9.5. 组织和细胞 RNA 的制备......................................................................................................................... 139
9.6. 哺乳动物细胞总 RNA 的分离................................................................................................................. 140
9.7. mRNA 的分离与纯化.............................................................................................................................. 142
6
9.8. RNA 质量的确定...................................................................................................................................... 143
9.9. RNA 酶保护试验...................................................................................................................................... 143
9.10. mRNA 差别显示技术.............................................................................................................................. 145
9.11. RT-PCR 简介............................................................................................................................................ 149
9.12. RT-PCR 引物设计原则和方法 ................................................................................................................ 151
9.13. RT-PCR..................................................................................................................................................... 152
9.14. RT-PCR 经验............................................................................................................................................ 153
9.15. 荧光 PCR 原理.......................................................................................................................................... 154
9.16. RNAi 实验原理与方法............................................................................................................................. 155
9.17. RNAi 技术新突破：根据 SNP 选择性沉默突变基因........................................................................... 159
9.18. RNAi：制备 siRNAs 的方法.................................................................................................................. 159
9.19. dsRNA 和 RNA 干扰技术 ...................................................................................................................... 164
10. 蛋白质异源表达、分离、纯化与鉴定 .............................................................................................168
10.1. 原核表达.................................................................................................................................................... 168
10.2. 原核表达的插入位点问题 ........................................................................................................................ 169
10.3. 工程菌发酵................................................................................................................................................ 170
10.4. 细胞破碎.................................................................................................................................................... 170
10.5. 蛋白含量测定方法.................................................................................................................................... 170
10.6. 包涵体复性................................................................................................................................................ 170
10.7. 重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量................................................................................................. 171
10.8. 表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析.......................................................................................................... 171
10.9. 选择材料及预处理.................................................................................................................................... 172
10.10. 蛋白质的分离纯化.................................................................................................................................... 173
10.11. 细胞的破碎................................................................................................................................................ 175
10.12. 浓缩、干燥及保存.................................................................................................................................... 175
10.13. 细菌蛋白质的透析体会 ............................................................................................................................ 176
10.14. 表达蛋白的分离与纯化 ............................................................................................................................ 177
10.15. 蛋白质提取方法例子................................................................................................................................ 178
11. 蛋白质组学.........................................................................................................................................180
11.1. 蛋白质组技术的研究进展 ........................................................................................................................ 180
11.2. 蛋白质组学及研究技术路线 .................................................................................................................... 184
11.3. 电泳技术简介............................................................................................................................................ 186
11.4. 等电聚焦电泳............................................................................................................................................ 190
11.5. 双向电泳的样品的制备 ............................................................................................................................ 192
11.6. 双向电泳操作步骤.................................................................................................................................... 193
11.7. SDS-PAGE 胶染色................................................................................................................................... 194
11.8. 双向电泳蛋白点的切取和保存 ................................................................................................................ 195
11.9. 数据库搜索(Databases search)........................................................................................................... 195
11.10. 主要的公共数据库及网址 ........................................................................................................................ 196
11.11. 双向电泳常见问题与原因 ........................................................................................................................ 196
11.12. 蛋白质的序列分析流程 ............................................................................................................................ 197
11.13. 聚丙烯酰胺凝胶的配制 ............................................................................................................................ 198
11.14. 双向电泳常用溶液配方 ............................................................................................................................ 199
12. 光滑球拟酵母相关参数测定.............................................................................................................201
12.1. 细胞干重.................................................................................................................................................... 201
12.2. 丙酮酸酶法测定方法................................................................................................................................ 201
7
12.3. 丙酮酸和α-KG 浓度 HPLC 测定方法..................................................................................................... 202
13. 微生物生理.........................................................................................................................................202
13.1. 细菌的生物化学试验................................................................................................................................ 202
13.2. MTT 法实验原理与 MTT 溶液的配制方法........................................................................................... 204
13.3. 酵母菌分类................................................................................................................................................ 204
13.4. 细胞凋亡的分子生物学检测方法............................................................................................................. 208
13.5. 液体培养中细胞凋亡（PCD）过程的监测............................................................................................ 209
14. 哺乳动物细胞及动物实验.................................................................................................................212
14.1. 真核细胞的转染........................................................................................................................................ 212
14.2. 转染细胞的稳定筛选................................................................................................................................ 212
14.3. 肿瘤细胞体外传代培养及保种 ................................................................................................................ 213
14.4. 肿瘤动物模型的建立................................................................................................................................ 213
14.5. 小鼠尾静脉注射方法................................................................................................................................ 213
14.6. 肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验 ................................................................................................................ 214
14.7. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养 ...................................................................................................... 214
14.8. 实验动物免疫方案.................................................................................................................................... 214
14.9. 血清制备.................................................................................................................................................... 215
14.10. ELISA......................................................................................................................................................... 215
14.11. 血清学筛选克隆新抗原/新基因............................................................................................................... 215
14.12. ELISPOT.................................................................................................................................................... 217
14.13. 藻酸盐包裹实验........................................................................................................................................ 217
14.14. 重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作（细菌内同源重组 AdEasy System） ...................... 218
14.15. 免疫组化染色............................................................................................................................................ 222
14.16. 流式细胞仪常用的几种检测方法............................................................................................................. 224
14.17. 人肿瘤抗原的识别与鉴定－免疫沉淀实验流程..................................................................................... 227
15. 附录-试剂配方...................................................................................................................................227
15.1. 常用贮液与溶液........................................................................................................................................ 228
15.2. 温度对常用缓冲液 pH 的影响................................................................................................................. 248
15.3. pH 计的使用方法..................................................................................................................................... 248
15.4. 电泳缓冲液、染料和凝胶加样液............................................................................................................. 250
15.5. 常用溶剂与水的共沸物数据 .................................................................................................................... 253
15.6. 不同温度下常见无机化合物的溶解度..................................................................................................... 254
15.7. 实验室常用技术参数资料 ........................................................................................................................ 262
15.8. 常用酶的配制............................................................................................................................................ 264
15.9. 杂交试验中用于降低背景的封闭剂......................................................................................................... 264
15.10. 常用凝胶的技术参数................................................................................................................................ 265
15.11. 遗传密码表................................................................................................................................................ 267
15.12. 常用酸碱技术参数.................................................................................................................................... 268
15.13. 20 种标准氨基酸的命名及性质............................................................................................................... 269
15.14. 常见的 E.coli End-和 End+菌............................................................................................................... 269
15.15. 常用质粒和粘粒载体的复制起始点和拷贝数......................................................................................... 270
15.16. 麦氏浊度计标准管配制方法 .................................................................................................................... 270
15.17. 常用培养基................................................................................................................................................ 270
15.18. 常用缓冲溶液............................................................................................................................................ 302
15.19. 常用抗生素................................................................................................................................................ 309
15.20. 细胞化学和细胞组分分离溶液 .................................................................................................................311
8
15.21. 细胞培养和细胞融合溶液 ........................................................................................................................ 313
15.22. 制备电镜标本的溶液................................................................................................................................ 314
15.23. 显影、定影溶液........................................................................................................................................ 315
15.24. 微生物学实验常用染色液的配制............................................................................................................. 316
15.25. 实验用水.................................................................................................................................................... 319
15.26. 各种核酸材料的贮存................................................................................................................................ 323
15.27. 分子生物学人员常用数据库 .................................................................................................................... 324
15.28. GeneBank 概览....................................................................................................................................... 328
15.29. 分子生物学人员常用软件 ........................................................................................................................ 335
15.30. 分子生物学实验中的细节问题和小技巧..............
基础系统操作挺全的，挺不错！ 挺不错的，感谢分享。
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