菌种保藏技术的进展

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微生物的生长周期短，能用工业生产，但是人为的不断传代伴随而来的缺陷是容易引起遗传变异。因此，从30年代开始就有菌种保藏的研究报告，并探索出了很多方法。许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构，如美国标准菌种收藏所（ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）、***大阪发酵研究所（LFO），还有全球性的世界微生物保存联盟（WFCC）。这些机构都出售和交换菌种并出版菌种目录。全世界的菌种保藏机构在300个以上。我国在1979年成立了中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），制订了组织和管理条件并设立6个保藏中心。菌种保藏的目的明确，在基础研究工作中，同一菌种在工作过程及结束后，均可获得重复的实验结果。对于有经济价值的生产菌，需要保持其高产的性能。通过生物工程技术所得的重组菌必须保持其遗传特性的稳定性。总之在保藏期内，既要随时可以使用这些菌种，又要尽可能减少甚至不产生遗传变异。本文介绍几种菌种保藏的方法。
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1． 斜面保藏法
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7 \9 m/ @: I7 P! d这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌及放线菌都可应用。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，一般在4℃左右可保藏3~6个月。到期后重新移种一次。当然保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要1~2周传代一次。这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒力减小甚至基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。目前许多实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞和减少碳水化合物的含量的方法，更有利于菌种的保藏。

2． 穿刺保藏法
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9 Z; [6 b  ?5 r3 G2 _9 Y此法是斜面保藏的一种改进方法，常用于保藏各种需气性细菌。方法是将培养基制成软琼脂（琼脂含量为斜面的1/2，一般为1%），盛入1.2×10cm的小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1/3。121℃高压灭菌后不制成斜面，用针形接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。培养后的微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长。然后覆盖以2~3mm的无菌液体石蜡。液体石蜡必须高压灭菌2次。这样的小管可在冰箱中保存以减少微生物的代谢作用。因此保藏效果较斜面为好。如果不用穿刺法而直接将液体石蜡加入生长好的斜面上亦可得到相似的效果，而且适用的范围较广，真菌放线菌都可适用。但发现液体石蜡减少应及时补充。穿刺法及液体石蜡覆盖法都很简便，但保藏期却因微生物种类不同而有很大的差异，真菌有的可保藏达10年之久，对一些形成孢子能力很差的丝状真菌，液体石蜡覆盖法行之有效。而另一些菌种如固氮菌、分支杆菌、沙门氏菌、毛霉等却不适宜。此外，从液体石蜡覆盖层下移种时，接种针在火焰上烧灼时菌体会随着液蜡四溅，如果培养物是病原菌时，应予注意。第一代的培养物会有液蜡的残迹和复壮问题，第二代才适于实验用。

- ^, |. P% e1 _& r) a3． 干燥保藏法
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/ ]1 x: N9 M; G4 d这种方法适用于形成芽孢子的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。一般将园土或耕作土研细、过筛（24筛目），干燥后使用，也可以用沙子过筛后以氢氧化钠和盐酸交替洗净后作为载体。在1.2×10cm小试管内盛入土壤或砂子至1cm高度，121℃高压灭菌2~3次。细菌可加入浓的悬液，真菌和放线菌可直接刮下孢子混和，大体上目测载体稍有湿润即可。小试管放入真空干燥器中或在干燥器中加五氧化二磷作为吸水剂干燥，试管口可熔封亦可用石蜡封口后，仍放在干燥器械内在5℃保藏。其保藏期一般为2年，有些微生物可长达10年之久。室温保藏效果较差。使用时，只需将少量土壤或砂子均匀倾倒在斜面上，生长好后再移种一次供使用。除了用土壤或砂子作为载体外，亦可使用6~12筛目过筛的硅胶、磁珠或多孔玻璃珠、以及曲子和麦粒来代替，硅胶必须是无色的，着色的硅胶指示剂对微生物有毒性，在硅胶中加入菌液时由于生产吸附热，温度会相应增高，接种时要将盛有硅胶的小试管置于水中冷却。砂子及土壤是更为常用的载体。
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4． 悬液保藏法

悬液法的基本原理是将微生物悬浮于不含养分的溶液如蒸馏水、0.25M磷酸缓冲液（Ph6.5）或生理盐水中保藏。适用于丝状真菌、酵母型真菌及细菌中的肠道菌科。大部分能保藏1年或更长。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口试管或一般试管加橡皮塞以防止水分的蒸发。保藏在4℃、10℃或室温（18~20℃）。目前国内生产厂应用玉米发酵醪在冰箱中保种，接种时即将老的发酵醪接入新鲜玉米醪，经热处理后进行保温培养。
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& O& V. z5 d. B0 g5． 液氮保藏法：液氮罐在目前来说已是实验室较容易购置。用液氮罐来保藏菌种，效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%二甲基亚砜（DMSO（作为防冻的保护剂灭菌后加入）pH7.6。这种营养明胶可制成良好的细菌悬液，许多细菌可保藏4年之久。此法操作简便但无菌要求较高。
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6．梭-氏（Sordelli）[4]真空干燥保藏法：此法的基本原理是将小试管中的菌液，不经过冷冻而直接抽干保藏。=般用0.8×6cm有棉塞的小试管，加入以脱脂牛乳等分散剂制成的细菌悬液。悬液中细菌的浓度应高而加入小试管的数量应少，一般不超过5滴，将小试管振荡使悬液附于管壁，贴上标签后，放入12×150cm的大试管中，大试管底部加入少量五氧化二磷及几粒小玻璃珠使小试管不直接与干燥剂接触。大试管的口上配有中间插有玻璃管的橡皮塞。将真空泵与橡皮管联接，抽真空至0.05托左右。可以用石蜡将橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部将大部试管拉细，第二次抽真空熔封。在5℃低温下保藏时，NCTC曾报道保藏了2724个菌种，14年后的存活率为83%。酵母及丝状真菌可保藏数年，但对一些敏感的菌珠不适用。

7．真空干燥保藏法：此法是在较高的真空度下，将液态样品直接减压干燥，常被称为L-干燥保藏法（drying from the liquid state的简称）。对于病毒、噬菌体、有些螺旋体效果胜于冷冻干燥法。细菌和酵母亦能使用。在安瓿管中加入1～2滴微生物悬液，切除管口棉塞并将棉塞部推入安瓿管内以便在棉塞上端将管子拉细。棉塞的松紧是操作的要点。这样的安瓿管直接装在孔管上用真空泵减压干燥，其真空度约至0.1托时表在同基本干燥后，再抽1h即可熔封。样品的温度有的是维持在20℃水浴中，有的装置可使温度降至10℃，但总不会达到冰点。干燥的时间需要10～20h或过夜。这种方法可能因使用不多，保藏期限报道较少。噬菌体的保藏期为5年左右。
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8．冷冻干燥保藏法

# h# z; R8 q% @+ b- J' i用这种方法保藏菌种已有几十年的历史，由于它具有保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围较广等优点，是各保藏机构使用的主要方法。曾有报导ATCC保藏的6,500个菌种中只有不到100个无法用这种方法保藏，病原菌中的98.5%适用。仅有一些不产孢子的丝状真菌不宜用此法。其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。此法可用小箱式或多孔道的冷冻干燥机进行，亦可自制一简单的装置进行。它的操作步骤稍复杂一些，下面将分别叙述。
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/ h2 g- l! G0 A. ^（1）收集菌种： 作为长期保藏的菌种，应当选择最适培养基和温度以便得到良好的培养物。培养时间要掌握在生长后期，因为对数生长期的细菌对冷冻干燥的抵抗力较弱，有孢子的微生物需适当的培养以期得到成熟的孢子。大致说，细菌是24~48h，酵母为72h，放线菌和丝状真菌是7~8天以上。从理论上说，最好是用生理盐水或缓冲液将斜面上刮下的菌体或孢子洗几次，以期洗净培养基中可能带来的各种物质。但在实际操作中如果洗净的条件不适宜会使细胞受损，同时也增加了污染的可能性，一般都省略了这一步骤。操作时先将少量分散剂（保护剂）加入斜面中，轻轻刮下菌苔或孢子，注意不要划破斜面而带入培养基，也可通过纱布脱脂棉的过滤，制成均匀的悬液。悬液的细胞浓度，因细菌和孢子大小不一，不易订出统一的标准，细菌可保持在109~1010/ml左右，孢子应尽可能分散从而制成20支安瓿管。如果用液体培养，则在离心后除去上清液，每10ml所得的菌体可加入1~2ml的分散剂。这个步骤中必需严格的遵守无菌操作和检验培养的程度，因保藏期较长，培养物不纯或操作污染都会造成不良的后果。制成悬液后即在同样严格的无菌条件下用毛细滴管加入灭菌好的安瓿管中，每个安瓿管装量约为0.1~0.2ml，但不必准确控制，通常加入3~4滴即可。

（2）安瓿管的准备: 冷冻干燥用的安瓿管形状不一，有的是直形小管，有的在底部带球形，有一些病原菌更需要在安瓿管内再装入很小的玻璃套以保证安全。安瓿管的内径为8~10mm，长度不小于100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐热、耐压、耐温度的骤变和管底厚度均匀，先用毛细滴管加入洗液浸泡过夜，第二天用水及蒸馏水洗净后干燥，瓶口加脱脂棉塞用纸包好，在121℃灭菌30min后，再在60℃烘箱中干燥。干燥温度不宜过高以防止脱脂棉被烤焦。
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（3）分散剂 ：分散剂或称保护剂，其作用有二：一是使悬浮液悬浮其中保持活的状态；二是减少冷冻干燥时对微生物引起的损伤。分散剂大致可分为低分子化合物如氨基酸、有机酸、糖类等；高分子化合物如蛋白质、多糖等，原则上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用马血清、NCTC用1:3的营养肉汤和马血清加入7.5%的葡萄糖。常用的是脱指牛乳和血清。最简单的是将普通牛乳离心后除去上层乳脂，常压灭菌3次每次1h，温度过高将影响保藏的效果。血清要过滤灭菌，牛乳可加热灭菌且冷冻干燥后易形成均匀粉末故更为常用。
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9 O8 h3 O; L3 f7 Q5 z（4）冷冻：装入悬液的安瓿管应立即冷冻，不宜放置过久。时间长了会使用菌体自行沉淀成为不均匀的悬液而不利冷冻，同时还会使分散剂起培养基的作用使微生物再次生长或萌发了孢子，这些情况都不利于长期保藏。冷冻的温度达到-30℃以下即可，有冷冻干燥机的可在冷冻架上进行，否则用一个盛有干冰的广口热水瓶将安瓿管在干冰中转动几下即可。冷冻后的安瓿管应立即真空干燥。

( g! q) z( X$ F  y5 p( l（5）真空干燥：真空干燥可用小箱式的冷冻干燥机，冷冻结束后立即启动真空泵，在15min内使小箱内真空度达到0.5托，1托的真空度约为1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。随着真空度上升至0.1 托以上，可以升高箱板的温度，使小箱内的温度升至25~30℃。此时由于升华还在继续，样品不会融化而能达到干燥的目的。如果有后干燥装置，可以利用油泵进行后干燥，真空箱内的真空度可达到0.01托以上，干燥效果更好。干燥完毕后关闭真空泵、排气、取出安瓿管将管颈拉细，再装在多孔管道上抽真空和融封。这种装置每次可冷冻干燥大量安瓿管，干燥度和真空度都较高，每次需要的时间较长约在10h以上。
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（6）离心式冷冻干燥机：另有一种带离心机的冷冻干燥机，其主要区别是在真空箱内装有一个可插入安瓿管口棉塞，插入预冷至-30℃~-50℃的小箱内离心机上。启动离心机及真空泵，约15min后真空度达0.1托时，样品已被冷冻。此时关闭离心机将样品抽干，如有加温装置，则在关闭离心机后逐步加温至25~30℃使样品加速干燥，这种装置可在数小时内完成全部过程。它的主要优点是在离心作用情况下抽真空，不会产生泡沫而影响冷冻干燥的效果，但是安瓿管数受离心插头号的限制和污染的机会较多，并不常被采用。冷冻干燥的装置还有钟罩式等，其基本原理与操作均相同，不一一列举。

（7）安瓿管的熔封：熔封必须在第二次抽真空情况下，在多孔管道上进行。一般使用二或三个喷嘴的煤气灯并由空气压缩机送入少量氧气。熔封技术需很熟练，因为既要达到熔封完全无任何泄漏，同时又要求外观完整均匀。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉细处。

（8）标签：安瓿管的标签应当予以必要的注意，在大量保藏菌种时不允许有任何的差错。可以在灭菌前加入有菌名、日期的小纸片，最简单的是在加悬液前加入有菌名、日期的小条胶布。应当避免用水溶性的笔来写标签。

（9）安瓿管的保藏及影响保藏因素：安瓿管可放在冰箱内在4~5℃低温下保藏。保藏期为5~10年。室温保藏的效果不佳。影响保藏期的因素很多，菌种、菌龄、冷冻干燥过程中各个环节都与之有关。保藏期和菌种变异关，在冷冻干燥中主要是由于干燥样品中含水量的影响。通常含水量在1~3%时较好，5~6%就会相应降低，虽然不一定进行含水量的测定，可用目测或真空度来控制，但应当引起必要的注意，此法保藏的菌种可以长期保藏菌种的稳定，有报道（2）将保藏10年的12个属的细菌进行生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌生理、生化、血清学的测定而没有发生变异，许多生产用的放线菌等微生物菌种亦都采用这种保藏方法达到长期保存的目的。

（10）安瓿管的启封：启封时，在无菌条件下，将溶封口处在火焰上稍加热，立即加上1~2滴无菌蒸馏水或用酒精棉花轻擦一下，使玻璃管产生裂缝，稍予轻击即可断落。加入最适生长的液体培养基少量使管内干燥粉末溶解，即可接种在斜面或液体培养基内，一般亦使用经过复壮的第二代菌种。 2006-6-29 13:23:37
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菌种保藏方法大全  
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基本原理
　　微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

% M) ]5 K0 ^# T: o　　低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

　　保藏方法大致可分为以下几种：
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! l, ?: [4 H  B* Y　　1．传代培养保藏法

& z( q2 D' X& {5 p, g. O5 W　　又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
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　　2．液体石蜡覆盖保藏法

; m% Q5 [  e" B  A! b/ t　　是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

+ s" K$ V8 Y: b& W( K/ d7 a9 m2 F　　3．载体保藏法
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　　是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
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% O( K, s1 D$ u( ?　　4．寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

3 j' P8 W3 b5 t, Y% }0 c# z3 ]　　5．冷冻保藏法
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& \- C$ I. R- Q! G' o9 [! C　　可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

　　6．冷冻干燥保藏法
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1 [$ ^* ?  ?! W- K5 M  h# {& Q3 m　　先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
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; f/ B! K. G0 y3 Y　　有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

　　三、器材
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$ L# V3 G1 R* _/ Z# C　　细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；
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　　肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

0 u6 ?' v5 m% y- n1 g　　灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
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( {' J+ t. B# }! K6 @4 O% J6 @　　四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点
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- ?1 ^( R+ Y- _　　下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。
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　　1．斜面低温保藏法
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　　将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

# B! p4 G: D/ Y0 G- i　　保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

　　此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

　　2．液体石蜡保藏法
( {0 j6 k( w! N6 V4 ^5 \: [
- J% M' n1 _. N' z5 i( ]　　（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

: s5 r& g$ ?3 B  K' d　　（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。
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　　（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。

, Y) |5 j$ T3 D# J: X" t3 {　　（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

　　此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
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　　3．滤纸保藏法
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, L1 y9 H$ R1 z/ ], X3 i$ @　　（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。
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　　（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。
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　　（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
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0 h( B1 O/ ~6 b& Y+ q8 |4 I　　（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
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1 `8 b/ J/ @; D% O　　（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
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　　（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

　　（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

/ }# R: r6 t$ {! Z" H+ l! z$ ?　　细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

　　4．沙土保藏法

　　（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

　　（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

# ?$ _& P0 |$ T  J$ g　　（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

　　（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

　　（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

　　（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

  |4 s6 f. }; p4 ?　　（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。
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) g4 A6 n# {6 d7 ?　　（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。
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2 W3 c1 @% o: e　　（9）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。

2 M8 d; i( m- [3 L7 p7 s  B　　（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

: b* E/ a9 ~8 C% g' u1 N　　（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

　　（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

　　（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

5 B) k. k0 v' ~" R　　此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。

　　5．液氮冷冻保藏法

　　（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。

　　（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。
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　　（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

5 b9 T# }' M- @　　（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
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( M, l% \* ?2 Y6 K) D( N　　（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

* z& W- ~' Y8 |. T& k　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

　　6．冷冻干燥保藏法

　　（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。
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$ C' w2 }4 K: S3 _/ s! p　　（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。
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- b9 k$ d4 f' g/ U　　（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
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  R# y2 j, I& B9 P# @　　（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

　　将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。
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　　（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
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　　抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。

　　（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

/ U5 V" `% \" Q- H4 i* {) @" V　　此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。  

转自网络---摘《丁香园》
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+ X# A- N) {5 H+ F) h" o2007-6-27 11:34:30
' }" p# s2 J. c" e. h( L1 \lingxingchen
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等级：消毒工
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1 U1 _3 [" x- v  g& _第 3 楼   

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最后的一种方法比较的保险,时间是最长的,我们一般采用这种方法,就是 预冻的温度有时候不知道幅度怎么控制!

龙游天下

好好学习天天向上

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