【工业发酵】染菌及其防治

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重点：工业发酵染菌的危害；染菌对不同品种发酵的影响；感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响；不同染菌时间对发酵的影响；染菌程度对发酵的影响；染菌对产物提取和产品质量的影响；染菌的检查与判断；发酵染菌率和染菌原因分析；杂菌污染途径及预防；

难点：染菌的检查与判断；发酵染菌率和染菌原因分析；

第一节  工业发酵染菌的危害

一、染菌对不同品种发酵的影响

二、感染不同种类和性质的杂菌对发酵的影响

三、不同污染时间对发酵的影响

四、染菌程度对发酵的影响

五、染菌对产物和产品质量的影响

第二节  染菌的检查、原因分析和防止措施

一、染菌的检查与判断

1.镜检：染色（革氏、芽孢、鞭毛等）

2.培养：平板、斜面

3.肉汤培养方法：

用这些方法没有发现染菌并不能肯定未被污染，还应结合其他异常现象来判断，如溶氧水平、pH值等。

二、发酵染菌率和染菌原因分析

1.发酵染菌率：一年内染菌批数占总的投料批数的百分率；

2.染菌分析：

三、杂菌污染途径及预防

1.种子带菌及防止；

2.无菌空气带菌及防止；

3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防止；

4.设备渗漏引起的染菌及防止；

5.操作不规范引起的染菌

第十四章  培养基与设备灭菌

重点：消毒与灭菌的区别；灭菌方法；加热灭菌的原理；影响培养基灭菌的其他因素；培养基灭菌时间计算；分批灭菌和连续灭菌比较；

难点：培养基灭菌时间计算；

第一节  消毒与灭菌的意义和方法

一、消毒与灭菌的区别

二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用

三、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）；

第二节  培养基和设备灭菌

一、加热灭菌的原理

1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；

2.微生物的热致死动力学：对数残留方程。

菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述。用N表示活菌个数，则活菌的减少率（死亡率）：与N呈线性关系，即：

式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。

在恒定温度下，将上式积分，边界条件 θ0 = 0 ，N = N0 ；

（θo =0 → θ = θ ；N = N0 → N = N）

式中，θ 灭菌时间（s）；Nθ 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个/ml）；N 经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。

在灭菌操作中，为达到一定的灭菌要求，即  为某值，如10-16 。则所需灭菌时间即可求出，由  。该式叫做对数残留公式。

若要求灭菌后绝对无菌，即N = 0 ，则从公式可以看出灭菌时间将等于无穷大。在生产上，通常取N = 10-3 个/罐为计算标准，即微生物污染降低到处理1000罐中只残留1个活微生物的程度，此数已能满足生产的要求，这样对于不同N0的培养基，其灭菌时间不同，即θ = θ（N0）。根据  ，在给定的温度条件下，θ与呈直线关系，其斜率为  ；当N0给定后，θ决定于K ；

3.热致死反应的速度常数K

K是表达微生物耐热性的特征常数，K除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数（与普通化学反应一样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心。

4.灭菌温度的选择

温度对化学反应的影响特别显著，主要是影响速度常数。1889年Arrhenius总结了大量实验事实，总结出反应速度常数与温度之间的定量关系式如下：

lnk




1/T


式中 ΔE为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的ΔE不同。ΔE可通过实验求得：由两边取对数  ，表明 与 之间呈直线关系，其斜率为  。在不同T时做灭菌实验，求得相应的K值，即可求出ΔE 。

ΔE不是决定K值的唯一因素，而是同T一起决定K值，即K = K（ΔE，T ）。为了寻求K的变化与ΔE及T之间的关系，将两边对T求导

； 表示对T的变化率，即。其值与ΔE成正相关，即ΔE愈高，变化率愈大，亦即T的变化对K的影响愈大。这是一个非常重要的结论。在生产上，可利用菌体死灭与营养成分被破坏的ΔE之差，来作为工艺选取的依据。通常，菌体死灭的ΔE约在200～400KJ/mol；而维生素被破坏的ΔE约在8～100 KJ/mol，灭菌中，温度升高，菌体死灭速率的增加远大于营养成分被破坏的增加，这就是高温短时间灭菌的依据。

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二、影响培养基灭菌的其他因素

培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫；

三、培养基灭菌时间的计算

P226、例14-1

四、分批灭菌与连续灭菌比较

连续灭菌的优势：

①可以采用高温短时灭菌；

②发酵罐利用率高；

③蒸汽负荷均衡；

④热效率高；

⑤可采用自动控制，降低劳动强度；

五、培养基与设备、管道灭菌条件

第十五章  空气除菌

重点：空气除菌方法；空气预处理流程；

第一节  空气中的微生物与除菌方法

一、空气中的微生物

含量、种类随空气状况而异；

就种类而言，通常细菌芽孢、霉菌孢子居多；空气中的微生物一般附着在尘埃、雾滴上；

二、空气除菌方法

1.加热灭菌：采用加热手段（电、蒸汽、空压机）将空气加热到灭菌温度进行灭菌。

2.静电电除尘：被电离的空气离子在向电极快速移动过程中撞击上空气中的尘埃、菌体后，使菌体、尘埃移向电极，最终沉降吸附在电极上，以达到除尘除菌的目的。

3.介质过滤除尘、除菌

实际使用时根据具体发酵选用除菌方式，一般常用过滤除菌的方法。

三、典型除尘、除菌流程

空气与水蒸气的混合物称为湿空气，完全不含水蒸气的空气称为干空气。自然界中的空气或多或少地含有若干水蒸气，因此都是湿空气。

经压缩冷却后的湿空气一般要析出过饱和的水分，另外还有从压缩机中带出的油雾杂质，如将之直接通入过滤器，空气中含有的油及水滴将污染过滤器中的介质。使过滤器很快失效或影响过滤效率。所以压缩空气在进入过滤器之前，必须进行减湿除油处理。即要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在50～60％的条件下过滤。

一般流程如下：高空采风→无油润滑空气压缩→贮罐→冷却→一次过滤→二次过滤→进入发酵罐

第二节  介质过滤除菌

绝对过滤（φ：0.1～0.5μm）

介质过滤：以纤维、颗粒状介质为过滤层（介质层厚）；以超细玻璃纤维等作为过滤介质（介质层薄）；

一、绝对过滤

1.过滤机理：

菌体、尘埃随气流穿过介质层时，与介质纤维发生撞击、静电吸附等作用而被捕集截留，从而达到除尘、除菌的目的；其机理中包括以下几种作用：惯性撞击、阻截、布朗扩散、重力沉降、静电吸附；微粒重量很小，可以忽略，对于静电吸附，目前的数据还不足以说明其规律性，因此在考虑捕集效率时，通常将重量、静电因素排除，不予考虑。

2.过滤效率

此处就过滤效率进行定性分析（对数穿透定律）

过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原来微粒数的比值，它是衡量过滤设备过滤能力的指标。

穿透率（P）为：

过滤效率：

：过滤前空气中的微粒数；：过滤后空气中的微粒数； ：穿透率；

研究空气过滤规律时，先排除一些复杂的因素。假设：①过滤器中的过滤介质每一纤维所处的空气流态并不因其他纤维的存在而受影响；②过滤器的过滤效率与空气中的微粒浓度无关；③空气中的微粒在滤层中的递减均匀，即每一层纤维薄层除去同样百分率的菌体。在这样的条件下，空气通过单位滤层后，微粒浓度下降与进入滤层的微粒浓度成正比。

：过滤前空气中的微粒数；

将上式变形后积分：

或

这就是对数穿透定律，表示进入滤层的微粒数与穿透滤层的微粒数之比的对数是滤层厚度的函数，常数K的值与空气流速、纤维充填密度和直径、空气中微粒大小等因素有关。

3.影响介质过滤效率的因素

介质厚度；介质密度；空气流速；

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发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。

发酵时感染杂菌，可引起下列后果：

1)        产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；

2)        在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；

3)        杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；

4)        杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；

5)        杂菌降解了所需要的产物；

6)        发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。

二  染菌的检查、原因分析和防治措施

1  染菌的检查与判断

1)        显微镜检查：通常用革兰氏染色法。先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。

2)        平板划线培养或斜面培养检查法

3)        肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。

此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。

2  发酵染菌率和染菌原因分析

发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。

由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。

3  杂菌污染途径及预防

杂菌污染途径及预防

1)      种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。

2)      无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。

3)      培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。

4)      设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。

5)      操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。

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对噬菌体的防治措施

1)        定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体。当发酵生产中已经发现了噬菌体的危害后，应立即在车间的各个工段及发酵罐的空气过滤系统、发酵液和排气口、污水排放处以及车间周围的环境中进行取样检测，从中找出噬菌体较集中的地方继而采取相应的措施。如对种子室和摇床间可采用甲醛熏蒸及紫外线处理的方法消灭噬菌体和杂菌。对常用器皿及发酵罐体表面，可采用新洁而灭及石炭酸溶液喷雾或擦洗。发酵系统则可采取改进空气过滤装置和蒸汽灭菌的方法。

2)        检查生产系统，消除各种不安全因素。在发酵生产中，当连续发生噬菌体污染后，往往在空气过滤装置及发酵罐底部、内壁、夹层以及管道和阀门接口等处容易存在蒸汽不能直接进入灭菌的死角，必须及早查出隐患，定期更换空气过滤器中过滤材料并改进工艺和设备，杜绝发酵液中的活菌和可能存在的噬菌体向周围的环境排放，彻底消除各种不安全因素，保证生产的正常进行。

3)        选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。选育抗噬菌体菌株是一种有效的手段，所获得的抗性菌株既要有较全面的抗性，并能保持原有的生产能力。对有的菌种在选育中很难做到既有抗性又能保持原有的生产能力。在可能情况下，针对噬菌体对侵染寄主具有专一性的特点，采用轮换使用生产菌株的方法，也可防止噬菌体的蔓延和危害，使生产得以正常进行。

4)        应急的挽救措施。在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确的判断，尽可能快地采取相应的挽救措施。常用的应急方法有以下几种：

①      加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。前者多系螯合剂如草酸及柠檬酸等；后者是一些抗生素，仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。

②      当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子（如玉米浆、酵母膏等），有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。

③      大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵制终点，防止倒灌，尽可能地减少因噬菌体污染所造成的损失。在补种之前也可对已感染了噬菌体的的发酵液低温灭菌。

wonderwei

这是哪本书 上的？

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做发酵关键是基础工作，把基础工作做好了，一切问题迎刃而解。

郭上根

在发酵罐中由于蛇管的漏洞导致的染菌尤为难发现，很多情况下蛇管是无法试漏出来。

limin198657

总结很不错，学习下