基因工程菌发酵及相关技术交流~！

lwdfjw

长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所学到的书本发酵知识，可能就是传统的大规模抗生素类或有机小分子产物的发酵。虽然在发酵原理上，以蛋白质为目的的基因工程菌发酵与其类似，但基因工程菌也有其独特之处。比如规模小，控制更精确，产物易失活等。
工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家试验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万别。有比较才有差距，有错误才能进步。
开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲试验中所遇到的困难，有什么好的经验体会等等。
                            ================================================================================
                 欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问题及经验介绍给大家，同时也欢迎把一些相关的新技术和方法与大家一起分享！
基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核表达系统（毕赤酵母），但实际应用过程中会遇到很多问题，你的经验及教训也许能帮助更多的人哦！
                            ================================================================================
                 个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方向有关的最具钱途的一个行业。
关于中国基因工程药物
一、中国基因工程药物产业化发展历史
新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分之二为化学制药厂，三分之一为中药厂，基因工程制药企业是一个起步较晚但发展较快的产业。目前已具生产能力的有三十余家。随着生物技术的不断发展，人们对新药的需求不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有人称它为“永远”的朝阳产业。

　　改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就投入资金，建立基因工程国家重点实验室，当时由于各方面的原因，立足于创新。这个时期有代表性的产品是rHUIFNαlb，系从人脐血白细胞经NDV－F病毒诱生后，提取mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。经过多年的中试研究，直到1989年始申报新药，1993年批准试生产，是我国第一个上市的基因工程药物，也是唯一的独创的一类新药。在这个时期同时研究的还有 rHUIFNα2a、 rHUIFNγ、 rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制药产业奠定了基础。

　　从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、EPO、tPA、Ser125IL－2等，其中除tPA未仿制成产品外，其余均申报为二类新药，进入临床试验阶段。

　　进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。这一阶段表现为：

　　1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。

　　2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。

　　3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。

　　4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。

　　二、中国基因工程药物产业化发展现状

　　据不完整的统计全国称为生物技术公司的企业有200多家，真正涉及基因工程技术的不足 100家。其中已申报基因工程药物在有关部门登记立项的60余家，已取得生产基因工程药

　　物试生产或正式生产文号的约30家。这些企业主要分布在一些经济发达的省、市和经济开发区，如北京、上海、深圳、吉林、浙江、江苏、山等。

　　就研究人员而言，我国生物技术经近十几年的发展，已经有一个初具规模和一定竞争力的研究队伍，以医药科研单位为核心，高等医药院校和综合大学生命科学院纷纷参与研究与开发工作，研究人员队伍在一万人以上。

　　我国基因工程药物产业化的品种从无到有，已发展到12种之多，见附表1、表2。它们是rHUIFNαlb、 rHUIFNα2a、 rHUIFNα2b、rHUIFNγ、 rHUIL-2、 rHUG-CSF、 rHUGM-CSF、rHUEPO、HGH、bFGF、rSK和基因重组乙肝疫苗。

　　已经进入临床阶段或尚在上游研制中的有Insulin、新型IL－2、EGF、rSAK、rHUIL－6、rHUIL－11、rHUIL－12、TNF衍生物、TPO、NGF、UK、SCF、Albumin和水蛭素等
                            ================================================================================
                 关于基因工程菌发酵的问题若有不妥之处，请大家多指正！
     利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺,就其选用的生物材料而言,前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;从发酵工艺考虑,生物工程菌的发酵生产之目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染,外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关,因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要
对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。
    基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。菌株的高密度生长将导致供氧不足和培养基中大量乙酸的产生，这将极大的影响菌体的生长，这是一个值得注意的地方；另外，菌体密度的高低与外源蛋白表达量之间并没有直接相关性，它们之间的结合点就是诱导条件的确定。另外，不同的发酵条件，工程菌的代谢途径也许不一样，这对目标蛋白的下游纯化工艺将造成不同的影响。因此，在高表达高密度的前提，尽量建立有利于纯化的发酵工艺也是非常重要的问题。
                            ================================================================================
                 和大家分享2篇文献，
关于基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究：
从基因工程菌(细胞)的生长动力学模型入手,阐述了导致基因工程菌不稳定的原因及不稳定性的表现;探讨了防止或降低基因工程菌不稳定性的对策,包括组建合适载体、选择适当宿主、施加选择压力、控制基因过量表达及控制培养条件等。
                                       

                                                                                                                                



基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究.CAJ
(293.7k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 第二篇：
关于基因工程菌发酵实验中培养基优化的数学模型
对重组人γ-干扰素的发酵培养基组分进行了数值研究.采用逐步回归技术并应用统计软件SAS对实验数据进行回归分析,建立了重组人γ-干扰素的产量同培养基组分之间的数学模型,并得出了最佳培养基的配方组成.为基因工程菌的发酵实验提供了可靠的理论依据.
                                       

                                                                                                                                



基因工程菌发酵实验中培养基优化的数学模型.CAJ
(104.87k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 基因工程菌的发酵与传统发酵有相关性又有独特性。许多东西是经验性的。
大家可以通过这个平台，介绍自己的基因工程发酵工作学习中的体会教训、以及具体从事过何种基因工程菌的发酵，发酵目的产物及发酵达到的规模水平如何？
具体工艺的交流按大家志愿吧。
^&^smile.gif[/img]

^&^smile.gif[/img]

                                        ================================================================================
                 我介绍一下我的工作学习（与基因工程菌相关的）：
1. 使用NBS 发酵罐（20L 80L）、B.Braun（5L 75L）、镇江（5L）；
2. 主要发酵菌为：E.coli BL21、E.coli DH5a、Pichia Pastoris。目标产物是：蛋白或质粒；
3. 高密度发酵高表达。
                                        ================================================================================
                 基因工程药物的生产系统
1．原核表达体系
　　大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
　　大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白。

　　2．真核表达体系
　　与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
                                        ================================================================================
                 我在做毕赤酵母转化的时候，载体的连接效率非常低，pPIC9K载体经常自连也转化不出来，请问大家有什么高招？
                                        ================================================================================
                 共享一些我喜欢的基因工程发酵相关的文献。
                                       

                                                                                                                                



entation Using a BioFlo 110 Benchtop Fermentor.rar
(276.41k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 共享一些我喜欢的基因工程发酵相关的文献。
                                       

                                                                                                                                



Fermentation Basics - E.coli.pdf
(82.0k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 好贴！大家继续讨论，谢谢！
                                        ================================================================================
                 CHO细胞发酵资料
                                       

                                                                                                                                



Culture Using a BioFlo 110 Benchtop Bioreactor.pdf
(135.25k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 谁有基因工程菌所用无机盐的范围，抗生素发酵中可以找到相应资料，基因工程菌应该有所不同吧？另外，大家发现基因工程菌发酵的接种量对收获和菌体及表达量影响大吗？主要指E.coli
                                        ================================================================================
                 xiaoxiao_ww wrote:
另外，大家发现基因工程菌发酵的接种量对收获和菌体及表达量影响大吗？


我也想知道！谢谢啊！！！
                                        ================================================================================
                 文献所述发酵罐培养时的接种量的大范围是4%-10％。在发酵罐培养时，我一般使用6％－8％的接种量。在此范围内我没有发现接种量对最终收获湿菌量和表达量有影响。超过10％的接种量就没有意义了，毕竟在摇瓶种子液中培养基成分与罐中培养基成分不一样，代谢产物积累量较大。低于4％的接种量，会对培养时间有所延长。
^&^smile.gif[/img]

                                        ================================================================================
                 谢谢！
                                        ================================================================================
                 我是做芽孢杆菌分泌表达系统的。
                                        ================================================================================
                 
To spore ：
我是做芽孢杆菌分泌表达系统的。

我对芽孢系统挺感兴趣的，能否介绍一下基因工程芽孢菌的构建发酵纯化能。
谢谢。
                                        ================================================================================
                 发酵基础。
                                       

                                                                                                                                



Fundamentals of Fermentation.pdf
(65.89k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 Scaling-Up from Spinners, T-Flasks %26 Shakers A versatile bioreactor for mammalian and microbial cells
                                       

                                                                                                                                



e bioreactor for mammalian and microbial cells.pdf
(135.94k)                                       
                                                                                                ================================================================================
                 skyboy wrote:
我介绍一下我的工作学习（与基因工程菌相关的）：
1. 使用NBS 发酵罐（20L 80L）、B.Braun（5L 75L）、镇江（5L）；
2. 主要发酵菌为：E.coli BL21、E.coli DH5a、Pichia Pastoris。目标产物是：蛋白或质粒；
3. 高密度发酵高表达。

与摇瓶比，罐单个细胞表达水平较低，尽管单位体积表达水平高于摇瓶的，如何解决这个问题？敬请各位同行赐教，拜谢了！
                                        ================================================================================
                 正好有篇文章与大家分享。
基因工程大肠杆菌发酵的研究.pdf

摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

关键词　基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗

作者：巫爱珍. 孙玉昆.  
刊名：生物工程学报

讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。

对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。

E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。

应用新型的发酵设备及电脑监控来测定发酵过程的碳源、氮源消耗、产酸量、产酸种类、pH、溶氧等等参数,并从中研究这些参数之间可能发生的相互之间的影响或作用等,对于发酵技术和工艺的改进是必要的,但菌体在发酵过程中的增殖周期是较短暂的,例如大肠杆菌每20min 即增殖一代,要将上述这些参数变化规律反馈于控制菌体在发酵过程中的快速增殖,尚难在发酵过程仅6 - 8h 内完成,因而为了快速、直接的监控是以菌体在发酵过程中的生长情况如菌体浓度或菌体湿重等为依据,控制必要的参数才能奏效。

基因工程菌的发酵是在传统发酵基础上建立起来的,但它却不是以传统发酵模式加现代化设备的简单组合来实现的,必须有新的调控概念突破传统概念的束缚,才能获得工程菌高密度及高效表达的结果。
                                        ================================================================================
                 skyboy wrote:

To spore ：
我是做芽孢杆菌分泌表达系统的。

我对芽孢系统挺感兴趣的，能否介绍一下基因工程芽孢菌的构建发酵纯化能。
谢谢。


我以前做过芽孢杆菌表达系统的专题讨论：


http://www.bioteq.org/bbs/viewthread.php?tid=480


比较详细，欢迎继续讨论！！！
                                        ================================================================================
                 
与摇瓶比，罐单个细胞表达水平较低，尽管单位体积表达水平高于摇瓶的，如何解决这个问题？敬请各位同行赐教，拜谢了！


1. 摇瓶培养与发酵罐培养，就从单个细胞而言不应该会低的多。正常培养应该是差不多的。
  当高表达的主代种子库建立后，实际上对于这株菌的表达量来说就已经定下来了。其实我们优化罐上培养条件目的也就是使在追求高密度培养时，使菌的表达量在不低于目标表达量的同时有所提高，毕竟从培养条件而言罐上要好的多。
  摇瓶培养在培养时间上要比罐上时间短的多，摇瓶一般在对数期中期就可以诱导，从单个细胞角度看绝大多数处于活跃的生长状态。而罐上培养的目的是提高BIO-MASS即高密度，随着培养时间的延长，占生物量大多数的菌保持着活跃的生长状态。
2. 我们在说表达量时往往不从单个细胞角度出发，而用单位体积表达量或单位菌量（g）表达量来说或比较。因为罐上培养已经由单个细胞水平上升到细胞群体的水平了。所以如你所说“单位体积表达水平高于摇瓶的”。
                                        ================================================================================
                 原核蛋白表达及纯化FAQ
1、怎样提高E.coli中6′His标签蛋白的表达水平？
        6 × His标签蛋白的表达水平低原因可能为：目标蛋白有毒或不稳定，或者是细菌生长过程中不能维持表达结构。有时候，插入片段的5’端序列编码了干扰转录或翻译的元件（比如有反向重复序列而形成茎环结构，掩盖了Shine-Dalgarno序列），在这种情况下，有必要检查和修改表达序列。改变培养基和宿主菌也可能会有所帮助。
外源性蛋白的表达会使宿主菌生长迟缓。高速的转录、翻译重组蛋白所需要的代谢消耗，导致宿主菌生长的缓慢。低浓度下即影响宿主菌生长的基因产物被认为‘有毒’，这样的产物包括细胞膜蛋白或与DNA相互作用或干扰电子传递的蛋白。为了降低有毒蛋白在被诱导前对宿主菌生长的影响，在无诱导的时候的基础转录水平越低越好，并且诱导前的细菌传代数要控制在最小范围。细菌生长过程中质粒的丢失有时候可以通过在培养基中加入高浓度的ampicillin (200ug/ml) 或carbenicillin (50ug/ml)得到解决。对于一些不稳定的表达结构，应当避免过夜培养起始菌。先从新鲜的培养基上挑选单克隆，少量培养后，2000倍稀释大量培养。

        含有疏水基团的重组蛋白往往对宿主菌有毒性。因此，除非有特殊的意义，应当去除插入片段中编码信号肽序列或穿膜区的序列。然而，也有少数包含信号肽的蛋白可以在膜间质少量的表达。这种情况下，建议诱导前培养温度降低为25度。

        有些蛋白，尤其是小于10KDa的蛋白在E. coli中不稳定，可能很快被细菌中的蛋白酶降解。克服这种困难的方法包括：降低培养温度到30度；使用一种或多种蛋白酶缺陷的宿主菌；使用QIAGEN公司的表达质粒pQE-16、pQE-40，使生成目标多肽与DHFR的融合蛋白；如果是纯化过程中蛋白易降解，则可以在纯化试剂中加入甘油以及蛋白酶抑制剂，并且确保整个操作在4度完成。

2、如何在E. coli中表达高度毒性的蛋白？
        在E. coli中表达高度毒性的蛋白往往是很困难的。毒性基因表达‘泄漏’会杀死宿主菌，尤其在早期的生长或转化后，可以使含有突变的不表达质粒的细菌选择性
生
   长。因此，要表达高毒性的蛋白，需要更高水平的lac 抑制蛋白。推荐同时使用QIAGEN公司的pQE-80L系列表达载体和M15[pREP4]宿主菌。pQE-80L系列表达载体带有lac抑制子基因，宿主菌M15[pREP4]带有pREP4质粒，两者持续的正向或反向高水平表达lac 抑制蛋白。这样协同作用，可以使诱导前的表达降低到最小的水平，因而提高成功表达毒性蛋白的可能性。

3、如何提高E. coli中可溶性蛋白的表达量？
        在E. coli 中表达的真核细胞蛋白往往形成不可溶的包含体。原因可能包括疏水基团的相互作用，半胱氨酸在E. coli 胞质还原性环境中不能正确形成二硫键。
QIAexpress 纯化系统的一个优点就在于包含体中带有6 × His标签的蛋白可以在变性剂作用下生成可溶性蛋白，然后用Ni-NTA纯化。如有必要，变性条件下纯化的蛋白可以复性，重新折叠。

        尽管如此，很多研究者还是发现纯化过程中的复性比较困难。另一个方法是调整表达环境使生成少量的可溶的天然构象的重组蛋白。即使形成了包含体，一些带6×His标签的蛋白仍可以在胞质中，这些胞质中的可溶性蛋白可以在天然的非变性的条件下被纯化。如果需要更多的可溶性蛋白，诱导后降低培养温度会有所帮助。培养温度常常直接影响蛋白表达水平和可溶性，降低温度可以降低表达水平从而使可溶性蛋白量增加。另外，也可以在诱导前让培养物达到更高的细胞密度而表达期控制在最短时间。IPTG的浓度可以从1mM降低到0.0005mM，使表达水平降低90%以上。并且，改变宿主菌也可能有效，因为某些菌比其它菌对某些蛋白的耐受性更好，可以生成更高浓度的可溶性蛋白。最后，很多蛋白需要金属协同因子才能够保持其可溶状态，因此在培养物中加入金属盐可能会有帮助。如果不知道蛋白所需的金属协同因子，则有必要测试不同的添加物。需要注意的是一些二价的阳离子会影响蛋白与Ni-NTA的结合。

4、如何在使用Ni-NTA纯化蛋白过程中去除富含组氨酸的杂蛋白？
        在结合试剂与洗脱试剂中加入20mM的咪唑（即使在变性条件下），可以抑制杂蛋白的结合。实验中逐步提高咪唑的浓度，以确定最佳的去除杂蛋白的浓度。
        过量使用Ni-NTA也会导致非特异性的结合。因此，对应于预期的表达蛋白量来确定合适的结合体系，可以减少非特异蛋白的结合。

        很多杂蛋白可能是由于非特异的离子作用引起的，因此纯化过程中确保在试剂中加入至少300mM的NaCl。
杂蛋白也可能与标签蛋白结合。加入b-ME（到20mM）可以解离杂蛋白与6′His标签蛋白间形成的二硫键。这在目标蛋白中包含相对多的半胱氨酸时尤其重要。

        杂蛋白与6′His标签蛋白的非特异性结合也可能是通过疏水作用产生。在洗脱液中加入以下物质可以减少因此而产生的非特异性：非离子洗涤剂（Trion X-100或Tween 20）;30%的乙醇或甘油。注意，不同的蛋白纯化所需加入的最佳浓度不同，需要试验摸索。

        杂蛋白也可能是截断的标签蛋白。这样的杂蛋白可以用Western Blot技术很容易的识别。通过质粒测序，检查出内部的翻译起始位点或成熟前的终止子。

5、Ni-NTA 是否能用于纯化含有内部His标签的蛋白？
        是的。Ni-NTA可以与His标签结合，无论标签位于蛋白的N端、C端或是内部。需要注意的是，在非变性条件下纯化时，His标签必须充分暴露在蛋白表面以利于充分的纯化。

6、是否可以把His标签从表达蛋白上切割掉？
        是的。QIAGEN提供一种载体，称为pQE-30 Xa, 与pQE-30相似，但在His标签与多克隆位点之间有编码因子Xa蛋白酶识别位点的序列。因子Xa蛋白酶可以在蛋白酶识别位点的精氨酸之后进行切割。经过因子Xa蛋白酶处理可以得到不含组氨酸的重组蛋白。

7、哪一种抗His抗体最灵敏？
        Penta His和Tetra His 抗体可以与含有6′His标签的蛋白结合，无论标签附近的氨基酸组成如何，甚至是在标签部分掩盖的情况下。这些抗体相对应的抗原识别位点的微小区别使得某些含有6′His标签的蛋白对某一个抗体的灵敏度高与另一个抗体。因此，为了得到最佳的结果，建议在实验的开始平行比较这些抗体。QIAGEN为此提供一种试剂盒Antibody Selector Kit，用于选择最佳的抗体。6His Protein Ladder 提供了蛋白分子量标准和Western Blot的阳性参照。
                                        ================================================================================
                 也发篇文章
基因工程菌高密度发酵工艺研究进展
来源：工业微生物

基因工程菌高密度发酵工艺研究进展



摘　要
　　阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。

关键词:
高密度发酵;　分批补料;　生长抑制因子

重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平[1,2]。　　
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清[3]。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1　重组大肠杆菌构建的几个影响因素
1.1宿主菌的选择　　
不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌[4]。表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性[5]。因此,不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。
1.2质粒载体　　
重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有ｐＥＴ、ｐＳＣ、ｐＰＢＢ、ｐＵＣ系列以及由它们衍生的一系列优化载体。
质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响,而且还取决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好,因为有些克隆的编码基因,当用高拷贝数质粒作载体时,其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢活动。质粒不稳定性通常有以下两种情况
^&^smile_sad.gif[/img]
1)分离不稳定性;(2)结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数,如葡萄糖、ＮＨ4+等因子的限量供应以及ｐＨ的变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了Ｅ.ｃｏｌｉＨＢ101(ｐＢＲ322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性影响,结果表明当温度在33～39℃、ｐＨ为6.4～7.2、ＤＯ为40%～80%时质粒没有丢失现象[6]。
2　培养条件
2.1营养源　　
高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要[7]。一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。葡萄糖(Ｇｌｕ)因细菌利用快且价廉易得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般Ｇｌｕ浓度控制在10ｇ/Ｌ左右,如果超过20ｇ/Ｌ将会抑制细胞的生长。同时已有人用甘油代替Ｇｌｕ作为细菌生长的碳源,以减少代谢抑制物质———乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。ＮＯ3-、胰蛋白胨(Ｔｒ)、酵母提取物(Ｙｅ)作为氮源有利于细胞的生长。比如,在硅藻类(Ｎｉｔｚｓｃｈｉａｌａｅｖｉｓ)高密度培养过程中提高十二碳五烯酸ＥＰＡ的产量时,ＮＯ3-∶Ｔｒ∶Ｙｅ的最佳比例为1∶2.6∶1.3,Ｇｌｕ∶ＮＯ3-的最佳比例为32∶1[1]。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系(ＶＥＲＯｃｅｌｌ)培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死亡[8]。　
　另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍[9]。2.2　控制条件
2.2.1　接种量　　接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用[10]。接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(%26gt;8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下[11]。
2.2.2　溶氧浓度　　溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧浓度。　　目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白(ＶＨＢ)[12];培养基中添加Ｈ2Ｏ2,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生Ｏ2;提高氧的分压[13]。
2.2.3　ｐＨ值　　稳定的ｐＨ值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的ｐＨ值变化会改变菌体细胞内的ｐＨ值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。Ｅ.ｃｏｌｉ发酵时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的ｐＨ值降低,细胞释放的ＣＯ2溶解于发酵液内与Ｈ2Ｏ作用生成的碳酸也会导致发酵液ｐＨ值的降低。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。必须及时调节ｐＨ值使之处于适宜的ｐＨ值范围内,避免ｐＨ值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。　　菌体生长和产物合成过程中,常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。
2.2.4　温度　　培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。
2.2.5　诱导剂及诱导时间控制　　乳糖基因(ｌａｃ)及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)做为诱导剂[14]或者以一定比例混合[15],诱导外源蛋白的表达。　　诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。　　诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
2.2.6　补料控制　　重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流加模式[5]:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。
除了补料技术的影响外,补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如在大肠杆菌表达重组绵羊生长激素(ｒ-ｏＧＨ)时,补料培养基的成分就包含有Ｇｌｕ和Ｙｅ,并在培养16ｈ后进行补料[16]。
3　生长抑制因子
3.1　乙酸的积累　　以Ｇｌｕ为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的Ｇｌｕ或补充Ｙｅ等来减少合成代谢。当残留的Ｇｌｕ浓度%26lt;1ｇ/Ｌ和乙酸浓度%26lt;2ｇ/Ｌ时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因子[17]。　　乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。
3.2　ＣＯ2的积累　　高密度发酵过程中,细菌代谢产物ＣＯ2的积累也会抑制外源蛋白的表达[18]。因为ＣＯ2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致ｐＨ值的下降。有报道多变鱼腥藻(Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ)[19]可以利用ＣＯ2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除ＣＯ的抑制作用。
4　发展与展望　　随着发酵控制手段的进一步发展,临控技术的掌握,发酵装置在线检测或控制物理化学参数、化学测量、生物学和生化测量,并提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息,作为控制发酵过程的依据。生物反应器也有了巨大的发展,比如膜反应器就可以透析除去发酵液中有害物质,从而实现工程菌的高密度发酵。　　
基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。
                                        ================================================================================
                 第一次发这么长的文章，嘿嘿～～






以前老板让给小弟弟小妹妹们做一个关于基因工程菌高密度发酵的报告，很是惭愧，其实我也是一点点也不懂"""
^&^smile_sad.gif[/img]

^&^smile_sad.gif[/img]

^&^smile_sad.gif[/img]
本科时学那点微生物及其发酵的只是基本上已经给扔了，遗憾的是本科时没有好好学学
^&^smile_cry.gif[/img]

^&^smile_cry.gif[/img]

^&^smile_cry.gif[/img]

^&^smile_cry.gif[/img]

不过我会努力的，努力向各位战友哥哥战友姐姐战友妹妹战友弟弟学习，哥哥姐姐弟弟妹妹要多多帮助啊，小弟在此先谢过啦～～
^&^kiss_smile.gif[/img]

^&^kiss_smile.gif[/img]

^&^kiss_smile.gif[/img]

^&^kiss_smile.gif[/img]

^&^kiss_smile.gif[/img]
。
                                        ================================================================================
                 真核荧光蛋白的表达FAQ
1、 检测不到瞬时转染细胞中的GFP表达，该怎么办？
1） 确定检测的方法正确，例如滤波片的设置；
2） 如果转染的是重组质粒，先用空白的质粒（无插入片段）作为对照，以确定检测方法正确；
3） 如果是重组质粒，对质粒与插入片段的连接处测序，确定阅读框正确；
4） 换一种转染细胞，常用的细胞有HeLa, COS, HEK293, CHO-K1, NIH3T3；
5） 优化转染条件，例如质粒量、转染试剂、转染时的细胞丰度。

2、 挑选了稳定表达GFP的克隆，培养后，发现荧光变弱或是不稳定，可能的原因是什么？
筛选任何稳定表达的基因，都有可能遇到类似的问题，因为荧光检测特别敏感、方便，所以这类问题更容易被观察到。出现这类问题，可能的原因是：
1） 挑选的单克隆不纯，混有其他细胞；
2） 即使是单克隆来源的细胞群，荧光的表达也可能不同。选择压力、细胞的生长丰度的改变都可能引起荧光表达不同。

3、挑选了稳定表达GFP的克隆，培养后，发现荧光变弱或是不稳定，该怎么办？
1） 瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。因此，稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞；
2） 确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达；
3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性；
4）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5；
5）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性；
6）可以通过流式细胞仪分析筛选高表达的细胞，以得到高水平表达的细胞株。这一筛选过程可以在药物筛选完成之后进行。

冰雪凌露

这么好的论坛这么好的帖子 还有这么有经验的楼主
真是生在福中不知福。

冰雪凌露

今天第一次来咱们论坛 是因为遇到问题在搜索的过程中见到了本论坛，真是不错。
同时在搜索了大半个论坛之后 觉得还是有点问题想请教总坛主：
我们用大肠杆菌发酵生产一种重组蛋白质（PET载体 BL21宿主），我想买个10L的罐子，不知道需不需要另外配备一个通纯氧的管路，来保证溶氧在20%以上（我看了一些文献在工程菌的分批补料发酵中大多都要有这个纯氧装置，【不过他们的工程菌都是高密度发酵，我的可以不是高密度发酵，但是我还想尽量提高一下产量，我的发酵周期也不长，只要能撑3天就足够了或者2天也差不多】）不知道我是不是也加一个纯氧装置，还是用普通的空气就可以来保证大肠杆菌对溶氧的要求。我同学处50L的罐子生产酵母菌体 安了一个纯氧的保证在20%左右。望各位专家多多指教。