洁净区沉降菌监测标准操作规程(SOP)

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原理：采用沉降法，即通过于培养皿中利用自然沉降原理收集在空气中的生物粒子，经不少于48小时的培养，在30—35℃下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。

" S4 J" T  K1 C& r) |" V主体内容：
1. 器材：
' y+ }8 H& ^5 f& c4 y( a高压消毒锅：使用时严格按照说明书操作。
恒温培养箱：必须定期对培养箱的温度计进行检定。
培养皿：Φ90mm玻璃培养皿
/ b8 t& f1 K2 j+ N7 @6 h培养基：营养琼脂
2. 操作程序
2.1 采样
* P* L  B( R( J1 O" N将已制备好的培养平皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖盖上后倒置。
4 w8 p3 @# C5 z2.2 培养：
+ _. H! q1 q3 H& z! {2.2.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
% `# k# L9 y, y& R2.2.2 在30~35℃培养箱中培养，时间不少于48小时。
0 n# d2 ~% ]  T+ X2.2.3 每批培养基应有对照实验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿做对照实验。
; g) r" c# f0 `* K6 X! z: p8 P: P7 v2.3 菌落记数
2.3.1用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5~10倍放大镜检查，是否有遗漏。
7 Q' R' V1 X+ D+ O2.3.2 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
2.4 注意事项
3 Q, a4 x6 P* r3 `/ p/ e2.4.1 测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
: A/ L. x4 C8 B7 {6 p2.4.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。
2.4.3 对培养基、培养条件及其他参数做详细的记录。
0 l; ^) q+ S! P% ~/ d2.4.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
2.4.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
0 A7 t1 M2 q* n+ ^3. 测试规则
. K( Y0 s3 _# |6 ?2 _- k4 ]; _' Z3.1 测试状态
9 w* ^3 m: _, a) s7 O" B% n0 {3.1.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
2 r+ r, `7 i1 b+ Q2 F# f% M3 N3.1.2 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。
5 A% {: X3 Y! k/ r( v4.1.3 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
: I: u1 M8 i" u1 s! r7 p* @# v) _3.2 测试人员
3.2.1 测试人员必须穿戴符合环境洁净级别的工作服。
0 h/ r* C' q; G3 M! N3.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。
  v) X2 n* h! S5 A: z3.3 测试时间
$ s5 z. d" O( r4 \% p3 v- O3.3.1 对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
3.3.2 对非单向流，如10,000级，100,000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟后开始。
; I3 ]" p  n% v: J3.4 沉降菌计数
+ X& _. e3 }) C6 T5 t+ J3.4.1 采样点数目及其布置
沉降菌测试的最少采样点数目可查表1确定。在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见表2。

/ C! E( O: L6 r, L# W表1 最小采样点数目
# r2 Z: U* l$ k( i/ ]
' b; }% S: d5 o7 o9 y面积
1 i+ S9 x. I9 ]3 Gm2  洁净度级别
9 |& O: p* C' q/ h0 L$ Y3 A  100  10,000  100,000  300,000
＜10  2~3  2  2  2
≥10~＜20  4  2  2  2
+ j2 m5 t7 Z2 Z* P) x& ]& Q2 }≥20~＜40  8  2  2  2
" l- H' Z1 F9 M; M4 ~1 m( Q≥40~＜100  16  4  2  2
; [" ?' z0 ]& x+ J. [≥100~＜200  40  10  3  2
8 g6 s+ g; H  r7 `注：表中的面积，对于单向流洁净室，指的是送风面积；对非单向流洁净室，指的是房间面积。
8 l; G  [+ c: g) r) C表2 最少培养皿数
洁净度级别  所需Φ90mm培养皿数
" s* T; i) z/ ~, ~! p100  　　　　　　　　14
10,000  　　　　　　　　2
5 E. i' ]' D' Q. C% J0 u100,000  　　　　　　　　2
300,000  　　　　　　　　2
3.5.2 采样点的位置
  C- B( f" j# m1 q, H. ]4 C! ]' w, o3.5.2.1工作区采样点的位置离地0.8~1.5m左右（略高于工作面）。
8 F0 ?( x3 ]! P6 w  }2 w' {7 G3.5.2.2 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
3.6 记录：测试报告中应记录房间温度、相对湿度及测试状态。
3 a) \2 H5 Z% _) ]7 K3.7 结果计算
3.7.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数.
& O* A" C! e; C% ?7 n2 [3.7.2平均菌落数的计算：
) g' o: h* w% j8 o: S$ X" h平均菌落数=（M1+M2+…Mn）/n
式中： M1 — 1号培养皿菌落数
* D, x5 S1 x9 U$ f- a: e　　 M2 — 2号培养皿菌落数
　　　 Mn — n号培养皿菌落数
　　　 n — 培养皿总数。
3.8 结果判定
4 Q2 ^6 i/ ^" I# v6 O# W# [( r( E用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物数。
3.8.1洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
3.8.2若某洁净室（区）内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均需合格。

附录
培养基的准备及灭菌
1. 培养基的准备
营养琼脂培养基可以外购或自行配制。自行配制方法见YY/T018 6-1995第6章无菌检查部分中关于此类培养基的配制和操作步骤。其他符合药典灵敏度要求的培养基亦可自行配制。
( ^. ~3 [" p4 N# P# U9 Z2. 营养琼脂培养基平皿的准备
2.1 将培养皿置于121℃湿热灭菌20min或180℃干热灭菌2h。
2.2 称取适量培养基于三角瓶中，加相应数量水加热使营养琼脂培养基溶解，用牛皮纸包扎，置于121℃湿热灭菌20min，冷却至45℃，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿。每皿约15ml。
2.3 待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃~35℃的恒温培养箱中培养48h，若培养皿基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
注：培养基平皿宜在2℃~8℃的环境中存放。