洁净区沉降菌监测标准操作规程(SOP)

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原理：采用沉降法，即通过于培养皿中利用自然沉降原理收集在空气中的生物粒子，经不少于48小时的培养，在30—35℃下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
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6 L& m: P# y+ {% |主体内容：
- Q: U0 Z2 `- ?# M7 w1. 器材：
高压消毒锅：使用时严格按照说明书操作。
恒温培养箱：必须定期对培养箱的温度计进行检定。
培养皿：Φ90mm玻璃培养皿
, {0 z2 x0 H" p4 B1 N- d  F培养基：营养琼脂
2. 操作程序
2.1 采样
2 D& z( {$ Z7 I9 e/ E  E/ o4 L将已制备好的培养平皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖盖上后倒置。
2.2 培养：
# k5 F2 q4 [# _; d  m" t1 t- H2.2.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
/ V" |' K3 W  _" M3 b* P% T3 s2.2.2 在30~35℃培养箱中培养，时间不少于48小时。
7 w4 b0 A2 |- ^5 E2.2.3 每批培养基应有对照实验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿做对照实验。
) l4 H% R6 x/ b2.3 菌落记数
6 @& D/ f( N; A+ F0 B3 U2.3.1用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5~10倍放大镜检查，是否有遗漏。
2.3.2 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
2.4 注意事项
2.4.1 测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
5 q$ z  v0 ~) A2 \$ c4 _2 I' D* ?2.4.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。
2.4.3 对培养基、培养条件及其他参数做详细的记录。
2.4.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
2.4.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
3. 测试规则
3.1 测试状态
& r* K) r7 ?  Y1 N% S  e" O" [3.1.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
! m- T+ e5 l: C: F, R3.1.2 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。
4.1.3 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
9 D0 X  A: R0 K/ g/ k3.2 测试人员
2 v" ]5 H8 S# ~5 V" h2 G  @, `5 K3.2.1 测试人员必须穿戴符合环境洁净级别的工作服。
. n1 E$ {+ ^+ r1 ^7 q  N3.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。
3.3 测试时间
* N, ?3 T0 X/ S1 d! ~0 h5 M1 D4 v3.3.1 对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
$ b6 q' x: w! a0 T+ ~1 `4 C3.3.2 对非单向流，如10,000级，100,000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟后开始。
4 N1 |( p4 Z6 H: c$ A% O1 [9 ?3.4 沉降菌计数
' \5 p  y0 b. V& W+ w3.4.1 采样点数目及其布置
沉降菌测试的最少采样点数目可查表1确定。在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见表2。
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表1 最小采样点数目

面积
m2  洁净度级别
  100  10,000  100,000  300,000
＜10  2~3  2  2  2
0 w; {8 a" b) N$ g6 @. w≥10~＜20  4  2  2  2
, s0 |3 S' t1 {≥20~＜40  8  2  2  2
≥40~＜100  16  4  2  2
≥100~＜200  40  10  3  2
注：表中的面积，对于单向流洁净室，指的是送风面积；对非单向流洁净室，指的是房间面积。
表2 最少培养皿数
洁净度级别  所需Φ90mm培养皿数
8 N& L* p: C6 E9 l100  　　　　　　　　14
10,000  　　　　　　　　2
7 j4 }. ^* Y# @6 p+ ~100,000  　　　　　　　　2
! a4 Y7 ~4 Q6 G1 ]300,000  　　　　　　　　2
3.5.2 采样点的位置
3.5.2.1工作区采样点的位置离地0.8~1.5m左右（略高于工作面）。
3.5.2.2 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
( G2 w" H* e: _) V3.6 记录：测试报告中应记录房间温度、相对湿度及测试状态。
3.7 结果计算
3.7.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数.
3.7.2平均菌落数的计算：
. k+ Z, [5 c  N- t3 T2 l平均菌落数=（M1+M2+…Mn）/n
式中： M1 — 1号培养皿菌落数
　　 M2 — 2号培养皿菌落数
　　　 Mn — n号培养皿菌落数
　　　 n — 培养皿总数。
3.8 结果判定
用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物数。
3.8.1洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
3.8.2若某洁净室（区）内的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均需合格。
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# L# F: _; J, }4 S; k# i6 l附录
培养基的准备及灭菌
; L+ f/ h, G/ T- z; s1. 培养基的准备
营养琼脂培养基可以外购或自行配制。自行配制方法见YY/T018 6-1995第6章无菌检查部分中关于此类培养基的配制和操作步骤。其他符合药典灵敏度要求的培养基亦可自行配制。
1 L. N% @3 I& j7 s0 I8 e2 D2. 营养琼脂培养基平皿的准备
2.1 将培养皿置于121℃湿热灭菌20min或180℃干热灭菌2h。
; H2 \* O/ N- _3 B! a1 c$ H2.2 称取适量培养基于三角瓶中，加相应数量水加热使营养琼脂培养基溶解，用牛皮纸包扎，置于121℃湿热灭菌20min，冷却至45℃，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿。每皿约15ml。
2.3 待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃~35℃的恒温培养箱中培养48h，若培养皿基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
$ `# E* _+ v# W; _: B. d$ N* u注：培养基平皿宜在2℃~8℃的环境中存放。