聊一聊青霉素生产之发酵

lwangd8

聊一聊青霉素生产之发酵 [ 森林阳光 ] 于:2009-01-31 03:15:30

发酵的目的是为了获得高质量、高产的抗生素。要达到这个目的，各个环节都是很重要的。上一篇所作的种种工作，是为菌种提供一个无菌的生长环境。有了这个基础，才能开展以后的各种工作。染菌是生产中最大的问题，一旦染菌，整罐的料废了，只能放下水道了。几十吨的料白白地排掉，看了真是心痛。
有了无菌的环境，还要有优良的种子和充足的养分。生产中，霉菌室把处于休眠状态的菌种活化，然后接入摇瓶、种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种。接种一般为5％～20％。根据菌种性质和生产规模来决定扩大培养的级数。一般都是二级培养。也就是说有一级种子罐和二级种子罐之分。

菌种经摇瓶培养好，需要转入一级种子罐。这一步骤要消毒工，操作工（也叫看罐的），和霉菌室人员配合完成。一方操作各种阀门保证罐压为微正压，一方打开接种口，点燃火圈，帮着拨去摇瓶瓶塞，种子室人员培养好的种子液倒入罐，最后关闭接种口。这一步骤完成后，种子就从摇瓶进入到生产设备中，开始大生产的第一步。

再从网上抄一段关于培养基的文字。http://www.ccthere.com/article/2007085
培养基：
1． 碳源：乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、油脂（天然）。
（从经济上考虑，主要为葡萄糖母液和工业用葡萄糖。）
（葡萄糖应注意葡萄糖效应：阻遏、抑制抗生素的合成。）http://www.ccthere.com/article/2007085
2． 氮源：氨基酸、玉米浆、花生粉、豆粉、玉米胚芽粉、尿素等。
3． 前体：苯乙酸、苯乙酰胺、苯乙胺等。（苯乙酸酯、醇类，以1.25～1.5％为宜，如苯乙酸月桂醇酯。）
4． 无机盐：S硫 （降低时产量降３倍）、P磷（降低时产量降1倍）、Ca钙、Mg镁、K钾（K:Ca:Mg =30:20:41）、 。
http://www.ccthere.com/article/2007085
具体的培养基控制就是围绕这几个方面进行控制，不同的时期加入不同的物料，目的就是为了能获取优质高产的抗生素。工厂中常用的词是为了提高收率。随着对菌种生长机理的研究的深入，生产所用的培养基也在有所改变。现在这方面的研究论文很多，细节要讲起来话就长了，我这二把刀就不费劲了，有兴趣上网找吧。

发酵生产过程控制常用的参数是：温度，pH, 溶氧，压力，电机转速等。还有一些间接参数，例如用显微镜来观察菌丝，得到细胞生长速率。这些参数中，温度，pH，溶氧是主要参数。
青霉素生产上采用变温控制。青霉菌适宜生长的温度是30摄氏度，而分泌青霉素的适宜温度在20摄氏度左右。在生产中，一级种子罐的温度常控在27摄氏度，二级种子罐的温度常控在25摄氏度；发酵前中期采用的温度是在26摄氏度左右，后期是在24摄氏度左右。因为发酵过程是一个发热过程，控温经常就是降温，大生产中通过自动或手动打开阀门，注入到发酵罐的夹套或蛇管中通过热交换来实现降温。
http://www.ccthere.com/article/2007085
过去在青霉素生产中，通过直接加酸（硫酸）或碱（氢氧化钠）来调节pH。随着对青霉素生长机理研究的深入，现在常采用控制补料速度结合加大通气量来调节。过去因为测量电极不过关，对pH的测量只能采取离线取样测。现在电极质量没有问题，在线测量从技术上完全能实现。可惜，过关的只是外国的电极，国产的还是不行。

青霉菌是好氧菌，在生产中要保持一定的溶解氧以维持它进行呼吸代谢和合成代谢。要维持一定的溶氧度，要从供需两方面入手。供，可以加大通气量，加大搅拌功率，加大搅拌转速入手。需，控制菌体浓度，在不影响产量和质量前提，使耗氧量不大于供应量。常用的手段也是控制补料，例如通过控制补糖速率来实现。
http://www.ccthere.com/article/2007085
要是一切顺利，各种参数控制得不错，没有染菌之类的事情发生，下一步就是放罐。放罐时间不是一个固定的时间，要结合收率、成本、质量来考虑。这也是通过不断的试验得到一些判断依据：发酵液单位增长速率放慢，菌丝形状，发酵液的pH值等。综合考虑下来，确定发酵终点。好了，发酵最后一步到了：放罐。

[ 本帖最后由 lwangd8 于 2009-2-3 14:05 编辑 ]

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下面就开始今天的内容：消毒。

消毒，是不是术语？也许灭菌更正式些。网上找来的定义：灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。灭菌实质上可分两种：杀菌和溶菌。前者指菌体已死，但形体尚存；后者指菌体被杀死后，其细胞形体被溶化或消灭。http://www.ccthere.com/article/2000171
在工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌。
干热灭菌和湿热灭菌都是利用高温来杀细菌，温度和时间是关键。干热灭菌常用于对铝瓶的灭菌，利用电炉丝产生的热来杀死细菌。

湿热灭菌在抗生素生产中很常用，就是利用高温蒸汽来灭菌。利用过滤介质来除菌在空气系统中最常用。利用初效过滤器、中效过滤器和高效过滤器组成的过滤系统分级净化空气，以获取满足生产要求的无菌空气。过滤系统中，最后一道关口高效过滤器的效芯的孔径最小可达0.3um，空气中细菌的一般直径约0.5微米，长度约0.5~5微米。这样，保证了经过过滤系统的空气是无菌的。  http://www.ccthere.com/article/2000171
化学药剂灭菌我就不多说了，别名酒精的乙醇是最常用的。射线灭菌在制约厂中也能见到：紫外线照射。在青霉素生产中，对培养基和发酵设备主要采用湿热灭菌和过滤介质除菌。
青霉素生产所用的菌种要求纯培养。在整个发酵过程中不能混有杂菌。否则，不但产量会下降，质量也会受到很大影响。杂菌分泌的生物酶会将青霉素溶解掉。这就是发酵系统必须经过严格灭菌后才能投用的原因。

在药厂中，灭菌人员叫消毒工。终于能把灭菌这个术语用熟悉的消毒代替了，真高兴啊。以下就用消毒了。消毒工比较牛。当一个好的消毒工要心细，所有的检查项目都要完成。此外，责任心要强，要保证所有的操作都严格按工艺来进行。http://www.ccthere.com/article/2000171

首先，要对整个发酵系统所有的设备进行消毒，这叫空消。染菌是发酵的大敌。系统不能有泄漏，不能有死角。在生产准备这个步骤所有努力就是消灭泄漏点和死角，保证系统外的杂菌没有机会进入到系统中。对系统内的杂菌，就要彻底地消灭它们。

如果你经过一个车间时，听到很刺耳的噪音的同时能看到成团的蒸汽不断地从厂房里窜出，这时就是对系统进行消毒。系统中这时没有任何物料，空空如也。空消的关键是要保证“活蒸汽”。排气阀要打开，保证让蒸汽在系统内呈流动状态。排水阀也要打开，让蒸汽系统中冷凝水排走，不然会降低温度。热力学的公式我就不写了，反正大家知道这是消毒时间的依据就行了。http://www.ccthere.com/article/2000171

经过空消，系统是无菌了，还有什么要消的？物料，对就是它。锅洗了，还要洗菜呢。在华药附近住的人，时不时能闻到一种味道。这种味道开始一闻，有点香，和馒头刚刚蒸好出锅时的味道差不多，隐隐有点甜味。可是闻多了，就有点反感，和糖吃多有点差不多。这种味道就是对培养基灭菌时的味道。对培养基消毒有两种方法。把培养基都投到罐里然后通蒸汽消毒，叫实消。这种方法消毒的效果好，可是对培养基的营养破坏有点大。火候不到，没有消透肯定不行；消毒的时间长了，肯定保证无菌，可是培养基的营养成分损失太大了也不行。这是一个有点让人头痛之处。
另一种方法是用设备把物料打到罐里，和蒸汽瞬间混和来达到消毒目的。这种消毒方法对培养基营养成分破坏小。和实消相比，多用了设备。这就意味系统复杂，染菌的机会就大了。

lwangd8

[ 森林阳光 ] 于:2009-01-19 02:51:01
菌种开始是从自然界选出的。可是这种纯天然的东西显然不能满足贪婪的人类的要求。怎么办，想尽各种仙招。紫外线照射，有效。化学诱剂也用上，激光也用上。总之，就是这样试来试去，有的菌种经不住折腾，死了；有的变异了，却不是人们所盼望的。没有关系，再来一次。现在用的菌种和最初的相比，可谓天壤之别。听说有的人在琢磨用细胞工程、基因工程的技术来改良菌种，这要是能成功那肯定是一个大突破。
菌种的培养基也是一个努力方向。培养基对菌种成长起到关键作用。吃得不好，吃得不香，怎么能顺利长大？一个好的培养基配方要通过多次试验才能确定下来。

生产准备一文中，忘了说空气过滤器的清理。空气过滤器要是清理得不好，无菌空气就无从提起。所有的滤芯要换新的，密封的垫片要换，阀门要换，压力表要校验。

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先复制一下从网上找来的工艺流程：
青霉素提炼工艺流程图：
发酵液———————→预处理液——→板框过滤——→滤液——→储罐——→BA提取——→脱色——→过滤——→BA脱色液——→结晶——→离心分离——→含１％水http://www.ccthere.com/article/2017698
重液回收溶媒
的异丙醇洗涤——→甩滤——→无水异丙醇洗涤——→甩干——→摇摆机粉碎——→烘干——→工业钾盐成品

发酵液是一个混合液，其中有菌丝、未用完的培养基、生产菌的代谢产物，一些杂质，青霉素的含量仅为0.1～4.5％。而且，溶液中的青霉素很不稳定，温度的变化、pH的变化都能引起青霉素的分解。提炼工艺要围绕时间，温度，pH，和去除杂质这四个基本点来改进。http://www.ccthere.com/article/2017698

提炼的第一步是发酵液的预处理。预处理的目的是为了改善发酵液性质，以利于下一步固液分离。发酵液中含有铁、镁、钙等无机离子和蛋白质，这些对提炼影响很大：不利于离子交换，蛋白质很容易引起萃取时的乳化－使溶媒和水相分离困难。生产中常用的方法是：加黄血盐去铁离子；加磷酸盐去钙，镁；加絮凝剂去蛋白质。

固液分离这一工序中，把发酵液中的固相的物质如菌丝、未用完的培养基和含有有效成分的液相分离来。常用的设备是板框过滤机和真空转鼓过滤机。印象中板框的处理能力比转鼓小？我个人比较喜欢转鼓。过滤下来的固相物质主要是菌丝，未用完的培养基，黄乎乎的，软软的，好在没有异味，要不发酵车间就成了那个啥了。这东东好象是能养猪？没有在发酵车间待过，不知道听来的是不是正确。不过，八几年时我还帮过同学去啤酒厂拉过这些东西来喂猪。http://www.ccthere.com/article/2017698

过滤后得到的液相中含有我们想得到的青霉素。文章开头的工艺流程我看有点不完全准确。在提取过程中就用BA提取含胡过去了。其实这有三步。从溶液中提取有效物质常用的方法有萃取法，离子交换法和沉淀法。青霉素生产中用的是萃取法。具体的三步包括一次萃取，然后用离心机将重相和轻相分开；然后将轻相反萃取，再用离心机分离重相和轻相；把重相进行二次萃取，再用离心机分开重相和轻相。最后得到的轻相是经过处理的溶液，其中含有高浓度的青霉素。BA是指醋酸丁脂，采用它的原因是青霉素在醋酸丁脂中的溶解度很小。反萃取的作用我记得是去杂质。

二次BA液中含有色素和热原质。生产中用活性碳来去除色和热原质。有专门的一个脱色罐。具体操作简单来说就是把一定量的二次BA液和一定量的活性碳在脱色罐中混合，开搅拌一定时间后将青霉素溶液经过滤器排出。http://www.ccthere.com/article/2017698

脱色后的溶液转入结晶罐结晶。在青霉素溶液中加入成盐剂并控制温度，青霉素盐晶体就可析出。对晶体再用丁醇洗涤干燥后就能得到青霉素工业盐。工业盐一般为钾盐。一般用来获取中间体6－APA。6－APA可用来深加工：生产阿莫西林、氨苄西林等产品。青霉素钾盐常用于肌注，青霉素钠盐可用于肌注和静脉注射。这些注射盐和工业盐不一样，结晶和干燥这些工序都要在无菌室中完成。加入的成盐剂的不同，能得钠盐或钾盐。还有的文献说钠盐是钾盐通过钠型离子交换树脂而制成的。同样，也有文章说二次BA中加入成盐剂后和三～四倍的体积的丁醇一起真空蒸馏也能制得晶体。

提炼和发酵相比一样重要。不过原来的观念中，一说青霉素生产人们往往联想的就是发酵。早先在青霉素的研究中，似乎对提炼的研究关注也不多，大多都集中中发酵这个方面。近期随着认识的深入，提炼的重要性得到了承认。这方面的投入也多起来。提炼工艺的改进，对最后的成品质量的提高有很大的好处。举例来说，去热原方面的改进对成品的质量就很显著。还有就是结晶方法的改进。当年兄弟在实验帮过几天忙。听工艺员说外国生产的青霉素的晶体就很一致，在显微镜下一看都是一个样。而国产的就有点缤纷多样了。晶型不一致，在溶解这个环节就很不好操作，国产的就不好溶。这从一个侧面反映结晶的研究还要深入，我们还有很多工作要做。http://www.ccthere.com/article/2017698

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空压站为青霉素生产提供空气。没有空气，好氧的产黄青霉菌根本无法生长。空气质量不好，供气量不足也对产量有很大影响。空气质量是指洁净度，温度和湿度。洁净度可从两方面入手：取气口的位置和过滤。

写到这想起培训时听老师讲的一件事。建国初期，国家决定建立抗生素厂。苏联提出选址的原则其中就有关于气候方面的要求。具体是些什么记不得了，就记住了不能湿润多雨。

湿润多雨的天气对空气的影响就是湿度大。湿度过大，空气系统的耗能就大；此外，湿润的空气容易引起空气带菌。当时就想，这是不是南方没有什么生产抗生素工厂的原因？梅雨，台风，想想就够了。

老师关于空气系统的取气口如何选取讲了好些内容。5米高的取气口如何，10米高的又如何等等。我当时听得是昏昏欲睡。反正我是不会去设计空压站，什么公式之类一点兴趣都没有。现在拼命地回想，就记住取气口越高，空气中的尘埃就越少，不过取气口高了，系统的功耗又大。反正有一些经验和相关的公式，设计人员就据此来确定取气口的高度。

空气进入空压机前要经过过滤以去取较大的尘埃。这一步只是简单的过滤。输入到生产车间的空气还要经过两级过滤后才能达到生产要求。空压机出口的空气压缩后温度会升高，然后要降温。冷却器中冷却水的压力不能高于空气压力。如果有泄漏的话，冷却水也不会进入到空气系统中。为了防止空气中有油和水，还要有去水和除油的装置。

动力是电，蒸汽，冷却水的总称，由动力车间负责。变电所把高压转换成生产用电和生活用电。华药的蒸汽是从石家庄热电厂买来的。蒸汽的要求是压力要恒定，不能有很大的波动，还不能夹带大量的冷凝水。冷却水一般是指循环水和七度水。加化学药品的水，经晾水塔降温后由泵加压输送到生产车间的设备，换热后经管道回到动力车间，于是叫循环水。循环水到了夏天就不能满足生产要求了：夏天气温高，经晾水塔降温的效果不明显。温度降不下来，发酵罐发烧可是一件了不得的事。到了夏天，动力车间要运行制冷机组为生产提供温度更低的冷却水。顾名思义，七度水就是指温度为七摄氏度的冷却水。其实到了用水的高峰有时候水的温度会上到十几摄氏度。http://www.ccthere.com/article/2032495.html

最大型的设备是发酵罐。华药最大的罐有120立方米。立方米这是书面用语。工厂中常用语是吨。罐越大，经济性就越好。不过还要考虑相关的问题：空气输送能力，冷却能力，维护能力等等。我上网查到的资料说最大的罐有500吨。也不知这么大的东西怎么装，怎么配搅拌电机。罐最初是碳钢罐，后来发现铁离子对青霉素生产不利，就改用搪瓷罐。搪瓷罐在使用中经常会掉瓷，逐渐被不锈钢罐所代替。发酵罐要有搅拌，要有通气口，要有冷却水接口，要有测量仪器的接口。上图说话。
  

上面的图中，发酵罐是用夹套冷却。这种设计一般用于中小型罐。

上面的图中，左边的罐也是用夹套冷却。右边的发酵罐是用盘管来冷却。盘管在罐内，还可以起到挡板的作用。盘管的换热效果也比夹套好，大型罐一般采用这种方式。

其它的大型设备有制冷机组，空调机组，各种泵，没有什么特殊的，不说也罢。

抗生素生产消耗的培养基数目是很大的。培养基主要成分由玉米制成。这也是抗生素厂建在北方的原因之一：离玉米产地近，运输压力不大。华药有专门的淀粉厂来加工玉米。注射药的小瓶由专门的玻璃厂生产。质检处，负责最后产品的质量检验。没有质检的质检报告，分装好的产品不可能出库。质检处还有一个部门叫动物场，饲养小白鼠，兔子来作试验。刚出生的小白鼠很可爱，经常被爱好小动物的女职工带到宿舍养着玩。所以在华药女单宿舍中的老鼠都是灰的：黑鼠和白鼠杂交的后代。

为了可持续地发展，研究所是必不可少的。销售很重要，采购也是必不可缺。林林总总，组成了一个整体。

最后简单说一说我国青霉素生产的历史。最先是在上海开始的。大规模生产是从58年成立的华北制药厂开始。华药建厂是我国建国初期156引进项目之一。人员中有一部分是上海调入的。经过几十年的发展，到了九十年代，形成青霉素的四大家。华北制药，河北制药，哈尔滨制药和鲁抗医药。而最新的资料显示现在国内生产能力超过万吨的是华星和石家庄制药。华星是河南新乡的一个乡镇企业，建于1985。石家庄制药是原来的河北制药和石家庄一药合并后的制药集团。

由于发达国家土地价格昂贵、环保要求 高和工资成本高及动力能源消耗大等因素，发达国家纷纷停止生物发酵原料药生产，向我国来购买原料药。这也是为什么在2000年后青霉素原料药价格突然上涨的原因。现在，中国成了全球青霉素最大的生产国，可我怎么也高兴不起来。在这背后，付出的代价是巨大的。不知道过上几十年，我们会不会后悔。

写完了。可算写完了。这文章写得心虚得不行。很多方面的知识只了解些皮毛，一写才发现无从下笔。写到第一个题目菌种就觉得写不下去了。这下深刻体会到硬着头皮的滋味了。除了专业知识，还发现自己的文笔也不行，距离河里的大拿们太远了。没有办法，人和人的差距就是太大了。唯一值得欣慰的是，我硬着头皮，磕磕吧吧写完了。欧也。

bobby3314

很好的东西 谢谢楼主