论单通道检测在发酵尾气分析中的应用

sws2605384

论单通道检测在发酵尾气分析中的应用

公维丽1，2，刘仲汇1，2，马耀宏1，2，史建国1，2
        (1．齐鲁工业大学(山东省科学院)  生物研究所，山东 济南 250014；2．山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

摘要：发酵尾气分析技术在业内的应用已逐渐展开，但人们对单通道检测的认识依旧模糊 。从尾气 分析的意义、生物过程的“实时性”以及发酵过程的“临界点”反映发酵状态的改变等方面，阐述了发 酵尾气分析应采用实时、连续、在线检测；通过以尾气分析获得的“临界点”在发酵工程中的应用(指 导转速调整、流加补料、乳糖诱导及处理异常发酵)，进一步阐明只有单通道检测才能真正做到检测 的实时、连续、在线，捕捉到有价值的“临界点”信息。
关键词：发酵；尾气分析；单通道；检测
中图分类号：Q819                   文献标志码：A                        文章编号：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas analysis

GONG Weili1，2，  LIU Zhonghui1，2，  MA Yaohong1，2，  SHI Jianguo1，2
        (1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)，  Biology Institute，Jinan 250014，  China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014，  China)

Abstract：  The  technology  of  fermentation  tail  gas  analysis  has  been  gradually  developed  and applied in the industry，  but single－channel detection is still poorly understood．  In this paper， we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection         from the significance of fermentation tail gas analysis，  the “real－time”of biological process，  and         the critical  point  of  fermentation  tail  gas  analysis  curve  reflecting  the  change  information  of process state，  and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering                 (guidance  of  speed  adjustment，   flow  feeding，   lactose  induction  and  treatment  of  abnormal         fermentation)  illustrated that only single channel detection can achieve real－time，  continuous and online detection，  and capture valuable “critical point”information．
Keywords：  fermentation；  tail gas analysis；  single channel；  detection

收稿日期：2022－09－01
基金项目：齐鲁工业大学科教产融合试点工程基础研究类基金资助项目 (2022PY067)；齐鲁工业大学科教产重大创新专项(2022JBZ01－06)； 山东省重点研发计划项目 (重大关键技术)(2016ZDJS07A20)
作者简介：公维丽(1988 — )，女，山东临沂人，副 研 究 员，研究方向为生物传感器技术 、微生物发酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：刘仲汇高级工程师，E－mail：sws2605384＠163．com。

发酵尾气分析指在发酵过程中在线检测尾气中 的 CO2   和 O2   的体 积 分 数，计 算 呼 吸 代 谢 参 数 CO2   释放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、摄 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到细胞代谢信息，是发酵工程 的一种过程分析技术(Process analysis technology， PAT)。  无论 是 在 微 生 物 生 长 阶 段，还 是 在 产 物 合成阶段，CER 的变化都与菌 体 生 长 状 态 、碳 源 的 消耗和供氧情 况 密 切 相 关 。  OUR 虽然取决于菌体浓度，但是也与发酵 液 的 营 养 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 体 的比生长 速 率 以 及 碳 源 的 种 类 和 浓 度 等 因 素 有 关 。RQ的变化反 映 了 微 生 物 胞 内 代 谢 的 变 化，揭 示 了发酵过程中微观代谢途径通量的变化，是 微 生 物 菌体生长 、能量代谢维持 、产物和副产物合成代谢共同作用的结果[1－7]  。利用这些参数及相关性分 析，可 以 更好地对发酵过程进行监测 、分析，从而深入了解发 酵规律，优化发酵 工 艺，控 制 发 酵 过 程，提 高 发 酵 产 率和产量，降低成本，加快新品研发和产业化 。
与溶解氧和 pH 检 测 相 比，尾 气 分 析 得 到 的 参 数 CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了发酵过 程的部分特质，揭示了微生物的生理特性，具有生物 学意义 。尾气分析时仅采集 发酵罐排出的尾气，不 影响发酵罐 结 构，不 接 触 发 酵 液，无 染 菌 风 险[8－10]， 更容易被业界接受，故成为现代发酵工程的重要分析 手段，已被应用于发酵、制药、生化、农业、环保和食品 等领域 。  虽然该技术已在业内得到应用，但是由于历 史原因以及设备成本等因素的影响，对检测设备是否 需要采用独立的单 通 道，认 识 依 旧 模 糊 。  因 此，笔 者 从理论与实际应用两方面对该问题加以分析探讨 。
1    发酵尾气分析应实时连续在线

在 发 酵 过 程 中，微 生 物 生 长 一 般 需 要 经 历 迟 缓 期 、对数生 长 期 、稳 定 期 和 衰 亡 期[11]  。  常 规 的 液 态 好氧分批发酵周期一般为数小时至数天 。在看似较 长的发酵过程中，发酵状态的转变 往往发生在很短 的时间内，某些代谢变化可能用时更短 。
张嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 过 程 优 化》[12]  及 相 关论 文[13]   中 详细阐述了生 物 过 程 的 “实 时 性 ”： 1)  从生物 过程发生的时 间以及 生物技术发展特点 来看，对于以活细 胞为主体的细胞 大规模培养的生 物反应过程，可粗分为在以基因水平的分子尺度 、代 谢调节的细胞尺度和工艺控制的反应器尺度上发生 的；2)  可将微 生 物 和 细 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亚基的结合和解离以及共价修饰和降 解) 控制的时间常数描述在毫秒至秒的范围内，在基 因表达调控水平上(诱 导 、转 录的阻遏和去阻遏) 描 述至分钟 。考察微 生 物 和 细 胞 代 谢 调 节，在 以 秒 为 单位的时间尺 度 上 是 合 适 的 。   因 此，作 为 动 态 观 测 记录细胞代谢状况 的 发 酵 尾 气 分 析 设 备，应 对 排 出 的尾气进行实时连续在线检测，只有这样，才能准确 捕捉到发酵过程中代谢的改变 。
2    合理利用发酵过程中的临界点

2．1    发酵过程中的临界点
李强等[14] 在《微生物发酵 中 二 氧 化 碳 释 放 速 率 变化规律》中，通过青霉素 、古龙酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 个体系的发酵实验及动力学分析，对 CER 的变化规律进行了探 究，研 究 结 果 表 明：无 论 是 霉 菌 、酵 母菌 、细 菌 、单 液 相 体 系 、双 液 相 体 系，还 是 纯 种 发 酵 、混合菌发 酵，CER 的 变 化 都 与 体 系 状 态 变 化 有 着密切联系；CER 曲线上的转 折 点 对 应 的 就 是 发 酵 状态的转变点 。   由该文献的 CER 曲线可以发现：在 这些转折点处曲线发生了方向性改变，即 由 升 转 为 降，或者由降转为 升，曲线出现明显的峰或谷，发 酵 体系的状态都发生了显著改变 。
在发酵过程中还存在另一类极具价值 的 变 化 点，即发酵体系的状态变化由缓慢到快速，或由快速 转为缓慢的时间点，比如在微生物生长由迟缓期进 入对数生长期，由 对数生长期进入稳定期以及由稳 定期进入衰亡期的那些时间点上，都有可能出现该 情况 。在这类时间点上，虽然发酵体系的 CER 曲线 没有发生方向性改 变(由 升到降或由降到升)，但 是 发生了变化速率的 显 著 改 变，或者说发生了从一个 发酵阶段转变到另一个发酵阶段 。这类变化点在发 酵过程中普遍存在，不仅有着明确的生物学意义，而 且具有非常重要的应用价值 。可将发酵过程中这类 变化速率显著改变 的 点，以及发生方向性改变的转 折点统称为临界变化点，简称“临界点”，其特征是发 酵体系发生了从一个状态到另一个状态的改变，亦 或从一个阶段到另一个阶段的改变 。
应用发酵尾气分析技术进行实时连续 在 线 监 测，可方便 、直观地获得发酵过程中的临界点 。这些 临界点提供的丰富信息可以帮助人们辨识发酵过程 状态，为 调 整 搅 拌 转 速／通 气 量 、流 加 补 料 、基 因 诱 导，以及异常 发酵处理等一系 列 工艺操 作提供 明确 指导，同时也为工艺放大提供对比数据 。充分重视和 利用这些临界点信息对优化发酵工艺具有重要意义 。
2．2    利用发酵过程临界点指导操作
2．2．1    利用临界点调整供氧
溶解氧是好氧发酵微生物生长及产物合成所必 需的 。在发酵过程 中，特 别是在高密度工程菌培养 中，溶解氧往往 成 为 限 制 性 因 素 。  如何适时调整搅 拌转速和通气量以达到最适溶解氧，是 发 酵 工 艺 的 关键点之一[15－17]  。  一般根据溶解 氧 DO、pH 及 镜 检 结果等进行调整，比较粗放，而利用尾气分析曲线的 临界点，则可以准确把握调整时机 。
在山东省科学 院 生 物 研 究 所 承 担 的“植 酸 酶 工 程菌高密度发酵智能控制关键技术”(山东省重点研 发计划项目 2016ZDJS07A20) 项 目 中，在 10L 实 验 室发酵罐上，采用 FGA 发 酵 尾 气 分 析 仪，对 重 组 毕 赤酵母表达植酸酶过程进行实时在线检测 。  发酵温 度 30 ℃，初 始 发 酵 液 体 积 7L，通 气 量 5L／min，搅拌转速 200r／min 。  发酵 6h5min 时，CER 开 始 缓 慢上升；发 酵 25h26 min 时，CER 出 现 快 速 上 升， 曲线上形成明显的 临 界 点，预示发 酵进入对数生长 期，此时 立刻调整搅拌转速至 400r／min；之 后 随 着 CER 的上升，阶段性小步调整搅拌转速达 530r／min， 并保持至 发 酵 48h30  min，之 后调整搅拌转速至 500r／min，直至 发 酵 结 束 。  该 发 酵 过 程 的 CER 变 化曲线如图 1 所示 。在该过程中，发 酵 15h 时 进 行 甲醇诱导，诱 导 5h 后 开 启 蛋 白 表 达，SDS－PAGE 检 测植酸酶表达见文献[18]，最终酶活达 3 000U／mL。


图 1    植酸酶工程菌高密度发酵尾气 CER 曲线     Fig．1    The tail gas CER curve ofengineered phytase productionstrain in high density fermentation
由图 1 可知：在临界点改变搅拌转速后，细胞快 速进入对数生长期 。  实验中根据临界点及曲线变化 趋 势，恰 当 掌握搅拌转速 调 整时机，满 足 供 氧 需 求，使植酸酶表达量及酶活均达较高水平 。
2．2．2    利用临界点进行补料
流加补料－分 批 发 酵[19－23]  是现代发酵工 程 普 遍 采用的方式，可以较好地解决底物阻遏，按设备能力 供氧，减缓代谢有害物的不利影响；尤其对于基因工 程菌高密度发酵，流加补料是实现高密度发酵必不 可少的手段 。流加补料技术的关键是对补料时机的 把握，利用发酵尾 气分析曲线中的临界点能够比较 精准地掌控补料时机 。
某大型药企在重 组 大 肠 杆 菌培养白细 胞 介 素－ Ⅱ 生产过程中，在 1t 生产罐上应用 FGA 发酵尾 气 分析仪，监测尾 气 变 化，其 发 酵 过 程 CER 曲 线 如 图 2 所 示 。   由 图 2 可 以 看 出 CO2    的 整 体 变 化 规 律： 1)  发酵开 始 后，CER 先 有 极 短 的 平 缓 区，很 快 在 1h32min时曲线 出 现 快 速 上 升 的 临 界 点，预 示 重 组大肠杆菌生长进入对数生长期，此时开始流加补 料，并根据 DO反馈值调整搅拌转速，保 持 DO 在 较 高水平 。2) 在 CER迅速上升的对数生长期，逐渐提 高流加补料速率，在达到峰值，出现临界点时，流加速 率达到最大 。3)  在 发 酵 后 期，补 料 速 率 维 持 在 某 一 稳定水平，直至发酵结 束 。整 个 发 酵 过 程 约 10h，产 物表达量 占 菌 体 总 蛋 白 的 40％ 。  发 酵 过 程 中 对 数 生长期起点和终点(临界 点) 的 出 现 都 发 生 在 1 min 内，如非采用实时连续在线检测是难以观察到的 。


图 2    重组大肠杆菌培养白细胞介素－ICER 曲线
Fig．2    CER curve of interleukin－I production strain of recombinant Escherichiacoli2．2．3    利用临界点进行诱导
在重组大 肠 杆 菌 发 酵 过 程 中，通 常 采 用 IPTG 诱导剂进 行 诱 导 。  IPTG 诱 导 剂 具 有 一 定 毒 性，对宿主和代谢产物有抑制作用，且 费 用 高 昂，在 工 业 化 大规模生产中较难推广 。乳糖是一种廉价资源，可以 作为碳源被大肠杆菌代谢利用，有报道在重组蛋白培养中用其作诱导剂，但尚不普遍，究其原因，除诱导机 理复杂外，乳糖诱导时机不易把握也是重要因素 。
张毅 等[24]  在 LB 培 养 基 中，分 别 在 对 数 生 长 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 对 融 合 蛋 白 表 达 菌 BL21         (DE3)(pFu) 进行 乳 糖 诱 导，发 现：乳糖的加入会造 成菌体生长迟滞，在 早 期 、中 期 进 行诱导均不理想， 只有在后期进行诱 导 效 果 最 佳，此 时既可以得到较 高的表达产物，又可以获得较高 的 菌 体 密度 。  有 研 究报道[22－30] 表明：在培养基葡萄糖刚刚耗尽，细胞浓 度增加缓慢或略有下降时开始诱导，效果最佳 。
应 用 发 酵 尾 气 分 析 技 术，可 以 直 观 地 辨 识 菌 体 生长的各个阶 段 。  一般在对 数生长期的后期，即 培 养基中葡萄糖刚刚 耗 尽，细胞浓度增加缓慢或略有 下降时，尾气分析的 CER 曲线会出现一个由上升转 为下降的临界点，利用该临界点可 以方便地确定诱 导时机，及时进行乳糖诱导 。
2．2．4    利用临界点处理异常发酵
虽然微生物发酵是一个非线性时变系统，包含了 生物、化学及物理的各种变化，过程较为复杂，但是当 各 种 条 件 固 定 后，微 生 物 细 胞 代 谢 又 遵 循 一 定 的 规 律 。从发酵尾气分析得到的大量数据来看，在某种发 酵体系中，当工艺条件确定后，其 分析曲线整体形态 是确定的，一旦发生改变，通常 预 示着某种代谢的改 变 。  因此，捕捉那些异 常 临 界 点，对异常发酵的及早 发现和处理很有意义，特别是对工业大生产和高附加 值的生物制药更是如此 。就此而言，尾气分析的敏感 性和实用性均超过了 pH 、DO等其他现有检测手段 。
在广东某高校进行的重组大肠杆菌发酵 药 物 蛋 白实验中，发酵开始后，经过短暂的迟缓期，CO2    曲线 开始缓慢上 升，约 2h 后 发 酵 快 速 进 入 对 数 生 长 期； 20min后，CO2    曲 线 突 然 出 现 了 下 折，CO2   体积分数 迅速下降，在不到 30min 的时间内下降到接种前水平， 镜检观察，发现此时发酵液中的工程菌已经消失，判断 感染了噬菌体，随即停止发酵，并迅速进行灭菌处理。 该实验过程的 CO2   体积分数变化曲线如图 3 所示。

图 3    重组大肠杆菌培养蛋白药物 CO2   曲线  Fig．3    CO2   curve of recombinant Escherichiacoliin protein drug fermentation process



3    实时连续在线检测

3．1    实时连续在线检测的意义
利 用 发 酵 尾 气 分 析 技 术，特 别 是 利 用 分 析 曲 线 上的临界点，监测发酵过程中细胞的代谢变化，可以 为发酵操作及进一步工艺优化提供 依 据 。  发酵尾气 分析技术的关键在于对发酵过程中尾气的 CO2   及 O2 进行实时连续在线监测，只有这样才能捕捉到发酵状 态改变的临界点，监测到细胞代谢状态的改变 。   由于 发酵过程中临界点的出现和状态的改变往往 发 生 在 极短的时间内，所以实时连续在线检测尤为重要 。   
3．2    采用单通道确保实时连续在线检测
随 着 现 代 科 技 的 发 展，发 酵 尾 气 分 析 所 采 用 的 各检测部件本身的响应时间非常短，一般在毫秒级， 但从发酵罐排气口到检测腔，尾气的传输需要时间， 相比之下检测时间 可 忽 略 不 计，故完成一次检测的 时间主要取决于尾气的传输时间 。
虽然采用一套检测部件加转换开关对多 套 发 酵 设备分时切换轮巡检测的方式，可以实现一套尾气分 析系统测定多点尾气，降低发 酵 设 备 的 平 均 成 本，但 是在切换过程中，气路转换无 法 瞬 间 完 成，必 须 反 复 用后一通道的尾气顶出前一通道的尾气，会造成尾气 混合带来检测误差，此外还存 在 传 输 时 间 长 、信 号 延 时等问题，也增加了 染 菌 风 险 。  因 此，在 进 行 发 酵 尾 气分析检测时，应 该 采 用 独 立 的 单 通 道 检 测，即一套 检测设备连接一个发酵罐，唯有采用此方式才可以实 现实时连续在线检测，捕捉到那些极其重要的临界点。
4    结  论

应用发酵尾气分析技术可以深入了解细胞的代 谢状况 。分析曲线上的“临界点”往往反映了发酵过 程状态的改变，对研究发 酵工艺至关重要 。  要 捕 捉 这些临界点就需要进行实时连续在线检测，唯 有 采 用独立的单通 道检测方能做到 。   目 前，发 酵 尾 气 分 析技术日臻成熟，尾气分析装置也成为发酵罐的标 准配置 。  随着设备的普及和尾气分析在多方面应用 的深入开展，业界对其应用效果的期望愈来愈高，单 通道检测 在发酵尾气分析中 的 意 义 会 日 益 清 晰 明 了，该检测方式有望被业界广泛接受 。
参考文献：
        [1]    ZHAO L，  FU H Y，  ZHOU W C，  et al．  Advances in process monitoring tools for cell culture bioprocesses[J]．Engineering in life sciences，2015，15(5)：459－468．
        [2]    BIECHELE P，  BUSSE C，  SOLLE D，  et al．  Sensor systems for  bioprocess  monitoring [J]．  Engineering  in  life  sciences， 2015，15(5)：469－488．
        [3]    储炬，李友荣．现代工业发酵调控学[ M]．3 版．北 京：化 学 工 业 出版社，2016．
        [4]    叶勤．发酵过程原理[ M]．北京：化学工业出版社，2005．
        [5]    王萍，王泽建，张嗣良．生理代谢参数 RQ在指导发 酵 过 程 优 化 中的应用[J]．中国生物工程杂志，2013，33(2)：88－95．
        [6]    刘仲汇，史建国，朱思荣，等．尾 气在线检测分析在发酵中的应用[J]．发酵科技通讯，2012，41(4)：32－35．
        [7]    王泽建，王萍，张琴，等．微生 物 发酵过程生理参数检测传感器技术与过程优化[J]．生物产业技术，2018(1)：19－32．
        [8]    徐有斌，章海红．尾气检测在泰乐菌素发酵中的作用[J]．生 物化工，2020，6(6)：61－64．
        [9]    HAUSMANN R，  HENKEL M，  HECKER F，  et al．  Present status of automation for industrial bioprocesses[ M]／／Current developments  in  biotechnology  and  bioengineering．   Amster－ dam：  Elsevier，2017：725－757．
        [10]    HüTTEL S，  MüLLER R．  Methods to optimize myxobacte－rial fermentations using off－gas analysis[J]．Microbial cell fac－ tories，2012，11(1)：1－11．
        [11]    沈萍．微生物学[ M]．北京：高等教育出版社，2000．
        [12]    张嗣良，储炬．多尺度微生物过程优化[ M]．北京：化学 工 业 出版社，2003．
        [13]    庄英萍，田锡炜，张嗣良．基 于 多尺度参数相关分析的细胞培养过程优化与放大[J]．生物产业技术，2018(1)：49－55．
        [14]    李强，曹竹安．微生物发酵中二氧化碳释放速率变化规律[J]．生物工程学报，1996，12(增刊 1)：237－242．
        [15]    LüP J，  QIANG S，LIU L，et al．  Dissolved－oxygen feedback control  fermentation  for  enhancing β－carotene  in  engineered Yarrowia  lipolytica [J]．  Scientific  reports，2020，10 ( 1 )：
17114．
        [16]    LOMAN A A，  ISLAM S M M，JU L K．  Production of Ara－bitol from  enzymatic  hydrolysate  of  soybean  flour  by  De－ baryomyces hansenii  fermentation[J]．  Applied  microbiology and biotechnology，2018，102(2)：641－653．
        [17]     GUO J J，  WU Y X，  TANAKA T，  et al．   Development of redox potential－driven  fermentation  process  for  recombinant protein  expression[J]．  Biotechnology  letters，2021，43 (1)： 99－103．
        [18]    王悦鹏，吴涛．微 生 物 发 酵 产 L－色氨酸的研究进展[J]．发 酵科技通讯，2020，49(3)：153－160．
        [19]    孙新强，陈 克 杰，杨 一 恭，等．营 养 条 件 和 温 度 对 利 福 霉 素 B生产强度的影响[J]．发酵科技通讯，2020，49(2)：63－67．
        [20]    韩庆晔，公维丽，史建国，等．通过参数相关性分析对发酵控制策略在植 酸酶高密度发酵中的作用探讨 [J]．工 业 微 生 物， 2021，51(1)：8－17．
        [21]    CHANG Y H，  CHANG K S，  CHEN C Y，  et al．  Enhance－ment of the efficiency of bioethanol production by Saccharo－ myces cerevisiae  via  gradually  batch－wise  and  fed－batch  in－ creasing the  glucose  concentration[J]．  Fermentation，2018， 4(2)：45．
        [22]    YU C L，WANG H P，QIAO T S，et al．  Afed－batch feeding with succinic  acid  strategy  for  astaxanthin  and  lipid  hyper－ production inHaematococcuspluviualis[J]．Bioresource tech－ nology，2021，340：125648．
        [23]    LIU W C，INWOOD S，GONG T，et al．  Fed－batch high－cell－
density  fermentation  strategies  for  Pichia pastoris  growth and production[J]．Critical reviews in biotechnology，2019，39         (2)：258－271．
        [24]    张毅，屈贤铭，杨胜利．乳糖 作 为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响[J]．生物工程学报，2000，16(4)：464－468．
        [25]    樊祥臣，陈瑞东，刘佳，等．L－谷氨酸氧化酶高密度发酵及催化合成 α－酮戊二酸[J]．过程工程学报，2016，16(2)：292－297．
        [26]    林 晓 栩，林 新 坚，邱 宏 端，等．乳糖诱导对重组大肠杆 菌 表 达CGTase 的影响[J]．食品工业科技，2015，36(17)：114－120．
        [27]    TIAN H S，  TANG L，  WANG Y，  et al．  Lactose induction increases production of recombinant keratinocyte growth fac－ tor－2in Escherichiacoli[J]．International journal of peptide research and therapeutics，2011，17(2)：123－129．
        [28]    WURM D J，  VEITER L，  ULONSKA S，  et al．  The E.coli pET expression system revisited：mechanistic correlation be－ tween glucose  and  lactose  uptake[J]． Applied  microbiology and biotechnology，2016，100(20)：8721－8729．
        [29]    FANG S Y，  LI J H，  LIU L，  et al．  Overproduction of alka－line polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by  a  two－stage  glycerol  feeding  approach [J]．  Bioresource technology，2011，102(22)：10671－10678．
        [30]     KITTLER  S，  KOPP J，  VEELENTURF P  G，  et  al．   The Lazarus Escherichia coli  effect：  recovery of productivity on glycerol／lactose mixed  feed  in  continuous  biomanufacturing         [J]．  Frontiers  in  bioengineering  and  biotechnology，2020， 8：993．
        (责任编辑：应艳杰)