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[讨论] 基因克隆技术全攻略-让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾

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  • TA的每日心情

    2020-6-29 17:24
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    [LV.4]偶尔看看III

    发表于 2011-9-5 20:09:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
    M-100系列生物传感分析仪快速、精确测定葡萄糖
    一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来,让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益,因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题,经过较长时间的总结和实践,我的题组现在的基因克隆都是一次到位的,基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒,不过我对科研非常热爱,我喜欢买实验用的各种酶啊,好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱,所以我看起来穿的及其普通,可是我的实验花费有点奢华,呵呵,可能像我这样的人不多吧,哈哈,反正无所谓开心就好。下面言归正传

    (1)是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶,这极大的丰富了我们的选择,所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同,最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧,其实不然,Takara几乎每年9月都有一次促销活动,在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶,这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用,而且长期五折,我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的,我一般不批量买了,在NEB买的一般都是不常用的酶,比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。

    (2)PCR引物的设计这一点我不想多说,虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等,大家设计的时候要参考各种原则,我认为不然,因为做过实验的战友都清楚,有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的,比如我要扩增一个完整的基因的ORF框,那么它的起始密码子,终止密码子部分都要克隆出来的,不能多也不能少一个碱基,即使起始部位或者终止部位的AT含量很高,高到你难以忍受,那怎么办呢,基本我们没有选择,如果实在是没办法的条件下,只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位,我不知道说清楚没有,如果引物序列OK,可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的,那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。

    (3)PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同,我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题,我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增,所以其实我的条件并不是最佳的,但当时把基因扩出来了我也没有在意,直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签,这样的PCR引物长度差异很大,一支引物100多bp,一支引物只有30bp,于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功,各种温度都试过了也不成。于是我静下心来,把PCR的实验条件进行了全方位优化,在PCR反应体系中,把引物调整到各种浓度的,把模板调整到各种浓度的,有的加Mg2+,有的加BSA,还使用梯度PCR的条件,试了各种扩增温度的,结果让我很开心,最后我的基因被扩增出来了,而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧!在这次试验中我找到了最佳的PCR条件,这是三年前的事了,这个条件让我在三年中屡试不爽,几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单,50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul(配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平,混匀,离心一下,进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存,吸取少量稀释十倍后用于PCR反应,这个浓度是最佳的。所以PCR体系中引物并不是越多越好,同样的模板的量也很关键,一般我都在10ng-100ng之间,太少或太多都会抑制PCR反应。当然,不同的基因其退火温度差异较大,建议第一次做直接做梯度PCR,设置的温度范围宽些,总会有扩出来的。反正把反应体系加好,把温度控制好应该就万事大吉了,如果这样仍然扩不出来,那就直接调整DNA模版的量吧,其他的因素应该不是原因(当然得保证引物,以及酶的质量得前提下)。

    (4)PCR产物的酶切,这是最简单的一步,一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要,毕竟保护性碱基只有几个。

    (5)质粒的酶切。虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究,决定着克隆的成败。质粒提取我一般都用试剂盒,天根的很便宜了,现在好像一盒已经六折,一盒有200个,可以用很久。质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定,根据A260的值计算出质粒的量,然后再进行酶切,一般酶切体系60ul,60ul体系中我只切总量1ug的质粒,一次切两管,酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收,这取决于两个限制性内切酶之间的距离,十几bp以内我就直接回收了,如果偏大就要切胶回收。

    (6)连接 连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶,它的特点是22度连接三小时以上几款,这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接,连接一个白天,到下午可以做转化了,涂板,过夜培养第二天早上看结果。然后挑克隆(一般我一个基因就挑四个克隆足已)培养一白天,下午稍晚些提质粒,然后马上酶切鉴定,一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系,酶用0.5微升就够了(呵呵,该省的就省点吧),酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了。这样从PCR到克隆鉴定完毕,一共三天。

    不过从我带学生的经验来看,从一个懵懵懂懂的新手到成功掌握该技术快则半个月,多则一个月,引人而异。各位也试试看吧!

    以上为本人在基因克隆方面的一家之言,难免有疏漏或过于肯定之处,感谢各位战友多提宝贵意见,多多交流,以后我会陆续贴出各种技术的实验心得,欢迎大家相互交流!

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    Abby2371 + 2 很给力!
    lwdfjw + 1

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    2021-10-19 14:53
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    [LV.3]偶尔看看II

    发表于 2021-9-30 09:59:25 | 显示全部楼层
    克隆少不了感受态,你们一般是买还是自己做
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