工业发酵培养基

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　　从微生物的营养要求来看，所有的微生物都需要碳源、氮源、无机元素、水、能源和生长物质，如果是好氧微生物则还需要氧气。碳源是供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。氮源主要是构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。微生物生长发育过程和生物合成过程也需要大量元素和微量元素，如镁、硫、磷、钾、锰等。一些特殊的微量生长因子如生物素、硫胺素、肌醇等，对缺陷型微生物是必不可少的。生物体内各种生化作用必须在水溶液中进行，营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。另外有些产品的生产还需要使用诱导剂、前体和促进剂。在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基是相当简单的，虽然它能满足微生物的生长要求，但在大规模生产上往往是不适合的。在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，使之尽可能地满足下列条件：① 消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率；② 能产生最高的产品或菌体的浓度；③ 能得到产物生成的最大速率；④ 副产品的得率最小；⑤ 价廉并具有稳定的质量；⑥ 来源丰富且供应充足；⑦ 通气和搅拌、提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易。
　　用甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、谷物淀粉等作为碳源，用铵盐、尿素、硝酸盐、玉米浆及发酵的残余物作为氮源，便能较好地满足上述配制培养基的条件。几种产品发酵培养基的例子见表3-27。
表3-27　发酵培养基例子

　　值得注意的是培养基的选择还会影响到发酵罐的设计。例如用甲醇和氨生产单细胞蛋白是用气升式反应器代替普通的机械通用搅拌罐，从而克服了由于高速通气和高速搅拌所产生的热量问题，并节约了能源。同样如果发酵罐是现成的，将很明显限制了培养基的选择。
　　从实验室放大到中试规模，最后到工业生产，放大效应会产生各种各样的问题。比如实验室使用的培养基一般黏度较高，而在大型发酵罐中使用，由于气液传递速率降低，高黏度的培养基显然要消耗更高的搅拌功率，故要加以调整。除了能满足生长和产物形成的要求外，培养基的组成也会影响到pH值的变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态。在培养基中，有时也需要添加前体物质或代谢的抑制剂，有时需加促进剂，以促进产物的形成。

1、工业上常用的碳源
　　在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。使用最广的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用其他农作物，如大米、马铃薯、番薯、木薯淀粉等。淀粉可用酸法或酶法水解产生葡萄糖，满足生产使用。表3-28是工业上常用的碳源及其来源。
表3-28　工业上常用的碳源及其来源

　　大麦经发芽制成麦芽，除了淀粉外，麦芽还含有许多糖分。麦芽是啤酒生产的主要原料或唯一原料，其碳水化合物组成见表3-29。麦芽汁也可由发芽的其他谷物制备得到。
表3-29　麦芽的碳水化合物组成(总干重)／％

　　蔗糖一般来自甘蔗或甜菜，在发酵培养基中常用的甜菜或甘蔗糖蜜是在糖精制过程中留下的残液。用于生产疫苗的动物细胞培养基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。
　　现在人们对诸如酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质在发酵过程中作为碳源越来越感兴趣，虽然它们的价格比相等数量的粗碳水化合物要昂贵得多，但由于纯度较高，便于发酵结束后产物的回收和精制。甲烷、甲醇和烷烃已经用于微生物菌体的生产，例如将甲醇作为底物生产单细胞蛋白，用烷烃进行有机酸、维生素等的生产。工业发酵过程碳源的选择主要取决于发酵的产品，当然也会受到政府法规等因素的影响。
2、工业上常用的氮源
　　工业生产上所用的微生物都能利用无机或有机氮源，无机氮源包括氨水、铵盐或硝酸盐等；有机氮源包括玉米浆(corn steep liquor，CSL)、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。其功能是构成菌体成分，作为酶的组成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。除玉米浆外，还有其他的一些原料如豆饼粉等，它们既能作氮源又能作碳源。表3-30是工业常用的氮源含氮量。
表3-30　工业上常用的氮源及含氮量(质量分数)／％

无机盐
　　无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基渗透压、调节pH值和氧化还原电位等。一般微生物所需要的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁、铁的化合物。还需要一些微量元素，如铜、锰、锌、钼、碘、溴等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。
　　⒈ 磷酸盐
　　磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)是重要的能量传递者，参与一系列的代谢反应。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01 mol／L。工业生产上常用K3PO4·3H2O、K3PO4和Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。K3PO4·3H2O含磷13.55％，当培养基中配用1～1.5 g／L时，磷浓度为0.0044～0.0066 mol／L。Na2HPO4·12H2O含磷8.7％，当培养基中配用1.7～2.0 g／L时，磷浓度为0.0048～0.00565 mol／L。另外，玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。磷酸(H3PO4)含磷为3.16％，当培养基中配用0.5～3.7 g／L时，磷浓度为0.005～0.007 mol／L。如果使用磷酸，应先用NaOH或KOH中和后加入。
　　磷含量对谷氨酸发酵影响很大。磷浓度过高时，菌体转向合成缬氨酸；但磷含量过低，菌体生长不好。
　　⒉ 硫酸镁
　　镁是某些细菌的叶绿素的组成分。虽并不参与任何细胞结构物质的组成，但它的离子状态是许多重要的酶(如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。如果镁离子含量太少，就影响基质的氧化。一般革兰阳性菌对Mg2+的最低要求量是25 mg／L，革兰阴性菌为4～5 mg／L。MgSO4·7H2O中含Mg2+ 9.87％，发酵培养基配用0.25～l g／L时，Mg2+浓度25～90 mg／L。
　　硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成分。硫是构成一些酶的活性基。培养基中的硫已在硫酸镁中供给，不必另加。
　　⒊ 钾盐
　　钾不参与细胞结构物质的组成，它是许多酶的激活剂。谷氨酸发酵产物生成所需要的钾盐比菌体生长需要量高。菌体生长需钾量约为0.1 g／L(以K2SO4计，以下同)，谷氨酸生成需钾量为0.2～1.0 g／L。钾对谷氨酸发酵有影响，钾盐少长菌体，钾盐足够产谷氨酸。当培养基中配用l g／L K3PO4·3H2O时，其钾浓度约为0.38 g／L。如果采用Na2HPO4·12H2O时，应配用0.3～0.6 g／L KCl，钾浓度为0.35～0.7 g／L。
　　⒋ 微量元素
　　还有许多元素，微生物需要量十分微小，但又是不可缺少的，称为微量元素。例如锰是某些酶的激活剂，羧化反应必须有锰参与，如谷氨酸生物合成途径中，草酰琥珀脱羧生成α-酮戊二醛是在Mn2+存在下完成的。一般培养基配用2 mg／L MnSO4·4H2O。铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的成分，又是若干酶的激活剂。
　　一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。必须指出，某些金属离子，特别是汞和铜离子，具有明显的毒性，抑制菌体生长和影响谷氨酸的合成，因此，必须避免有害离子加入培养基中。
生长因子
　　从广义来说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。
　　目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型(biotin auxotroph)，以生物素为生长因子。有些菌株还可以硫胺素为生长因子，有些变异株油酸缺陷型以油酸为生长因子。
　　⒈ 生物素
　　生物素的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累都有影响，大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。谷氨酸发酵最适的生物素浓度随菌种、碳源种类和浓度以及供氧条件不同而异，一般为5 μg／L左右。如果生物素过量，就大量繁殖而不产或少产谷氨酸，而产乳酸或琥珀酸，在生产中表现为长菌快，pH值低，尿素消耗多。若生物素不足，菌体生长不好，谷氨酸产量也低，表现为长菌慢，耗糖慢，发酵周期长。当供氧不足，生物素过量时，则发酵向乳酸发酵转换。供氧充足，生物素过量，糖代谢倾向于完全氧化。
　　菌体从培养液中摄取生物素的速度是很快的，远远超过菌体繁殖所消耗的生物素量，因此，培养液中残留的生物素量很低，在发酵过程中菌体内生物素含量由“丰富转向贫乏”过渡。有人试验得出结果，当菌体内生物素从20 μg／g干菌体降到0.5 μg／g干菌体，菌体就停止生长，继续发酵，在适宜条件下就大量积累谷氨酸。
　　生物素是B族维生素的一种，又叫做维生素H或辅酶R，其结构式如下：

　　生物素是一种弱一元酸(Kα＝6.3×10-8)，在25 ℃时，在水中的溶解度为22 mg／100 mL，在酒精中为80 mg／100 mL。它的钠盐溶解度很大，在酸性或中性水溶液中对热较稳定。
　　生物素存在于动植物的组织中，多与蛋白质呈结合状态存在，用酸水解可以分开。生产上可作为生物素来源的原料及其生物素含量见表3-31。此外，米糠中含量为270 μg／kg，酵母中含量为600～1800 μg／kg，豆饼水解液中含量为120 μg／kg。
表3-31　某些有机氮源的主要成分

　　⒉ 维生素B1(硫胺素)
　　维生素B1对某些谷氨酸菌种的发酵有促进作用。其在水中的溶解度为100 g／100 mL。其1％水溶液的pH值为3.13；0.1％水溶液pH值为3.58。pH值5.5的硫胺素盐酸盐水溶液在120 ℃加热稳定，pH值5.5以上易破坏，有氧化剂或还原剂存在时易失活性。
　　⒊ 提供生长因子的农副产品原料
　　⑴ 玉米浆　玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物，也是玉米淀粉生产的副产品，它的主要成分见表3-32。
表3-32　玉米浆的成分

　　玉米浆的成分因玉米原料来源及处理方法而变动。每批原料变动时均需进行小型试验，以确定用量。玉米浆用量还应根据淀粉原料不同，糖浓度及发酵条件不同而异。一般用量为0.4％～0.8％。虽然玉米浆主要用作氮源，但它含有乳酸、少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，因此常用作为提供生长因子的物质。
　　⑵ 麸皮水解液　可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1％(干麸皮计)左右。麸皮水解条件如下：
　　① 以干麸皮:水: 盐酸=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以0．07～0．08 MPa表压加热水解70～80 min。② 以干麸皮:水=1:20，用盐酸调pH值1.0，以0.25 MPa表压加热水解20 min。然后过滤取滤液。
　　⑶ 糖蜜　甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低。甘蔗糖蜜用量为0.1％～0.4％。
　　⑷ 酵母　可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。
前体物质和促进剂
　　随着原料转换，生产菌种不断更新，为了进一步大幅度提高发酵产率，在某些工业发酵过程中，发酵培养基除了碳源、氮源、无机盐、生长因子和水分等五大成分外，考虑到代谢控制方面，还需要添加某些特殊功用的物质。这些物质加入到培养基中有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长。例如某些氨基酸、抗生素、核苷酸和酶制剂的发酵需要添加前体物质、促进剂、抑制剂及中间补料等。添加这些物质往往与菌种特性和生物合成产物的代谢控制有关，目的在于大幅度提高发酵产率、降低成本。
　　⒈ 前体物质
　　某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高，这类化合物称为前体物质。有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。例如丝氨酸、色氨酸、异亮氨酸及苏氨酸发酵时，培养基中分别添加各种氨基酸的前体物质如甘氨酸、吲哚、2-羟基-4-甲基硫代丁酸、α-氨基丁酸及高丝氨酸等，这样可避免氨基酸合成途径的反馈和抑制作用，从而获得较高的产率。目前应用添加前体物质的方法大规模发酵生产丝氨酸在日本已经实现，色氨酸和蛋氨酸的生产也可望工业化。又如5’-核苷酸可以由糖在加有化学合成的腺嘌呤为前体物质情况下，用腺嘌呤或鸟嘌呤缺陷变异菌株直接发酵生成。氨基酸发酵的前体物质如表3-33所示。
表3-33　氨基酸发酵的前体物质

　　抗生素合成的前体物质在一定条件下可控制生产菌的合成方向和增加抗生素的产量。在青霉素的生产过程中，人们发现加入玉米浆后，青霉素的单位提高，进一步研究发现单位增长的原因是玉米浆中含有苯乙胺。抗生素发酵常用前体物质如表3-34所示。苯乙酸、苯乙硫胺、丙酸均可以在生产过程中使用，但要注意这些前体加入过多对菌体会产生毒性。因此在发酵过程中，加入前体不但可使其青霉素G比例大为增加(占总青霉素量的99％以上)，且使青霉素的产量有所提高(由于前体物质的存在，可使培养基的硫酸盐中的硫原子更多地结合到青霉素分子中去)。
表3-34　抗生素发酵常用的前体物质

　　前体物质的利用往往与菌种的特性和菌龄有关，如两种青霉素产生菌对苯乙酸的利用率不同，形成青霉素G的比例也不同，较老的菌丝对前体的利用较大。前体物质愈易被氧化的，用于构成青霉菌分子的比例就越少。
　　一般说来，当前体物质是合成过程中的限制因素时，前体物质加入量越多，抗生素产量就越高(见表3-35)。但前体物质的浓度越大，利用率越低。在抗生素发酵中大多数的前体物质对生产菌体有毒性，故一次加入量不宜过大。为了避免前体物质浓度过大，一般采取间隙分批添加或连续滴加的方法加入。
表3-35　不同浓度的前体物质对青霉素产量的影响

　　⒉ 发酵过程中的促进剂和抑制剂
　　在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵生产过程中，可以在发酵培养基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或刺激剂。例如在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。
添加诱导物，对产诱导酶(如水解酶类)的微生物来说，可使原来很低的产酶量大幅度地提高，这在生产酶制剂新品种时尤其明显。一般的诱导物是相应酶的作用底物或一些底物类似物，这些物质可以“启动”微生物体内的产酶机构，如果没有这些物质，这种机构通常是没有活性的，产酶是受阻抑的。
　　在培养基中添加微量的促进剂可大大地增加某些微生物酶的产量。常用促进剂有各种表面活性剂(洗净剂、吐温80、植酸等)、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。如栖土曲霉3942生产蛋白酶时，在发酵2～8 h添加0.1％LS洗净剂(即脂肪酰胺磺酸钠)，就可使蛋白酶产量提高50％以上。添加占培养基0.02％～1％的植酸盐可显著地提高枯草杆菌、假单胞菌、酵母、曲霉等的产酶量。在生产葡萄糖氧化酶时，加入金属螯合剂二乙胺四乙酸(EDTA)对酶的形成有显著影响，酶活力随二乙胺四乙酸用量而递增。又如添加大豆油抽提物，米曲霉蛋白酶可提高187％的产量，脂肪酶可提高150％的产量。在酶制剂发酵过程中添加促进剂能促进产量增加的原因主要是改进了细胞膜的渗透性，同时增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。
　　抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂(见表3-36)，常可促进抗生素的生物合成。在不同的情况下，不同的促进剂所起的作用也各不相同。有的可能起生长因子的作用，如加入微量植物刺激剂可促进某些放线菌的生长发育，缩短发酵周期或提高抗生素发酵单位；有的可推迟菌体的自溶，如巴比妥药物能增加链霉素产生菌的菌丝抗自溶能力(巴比妥主要对链霉素生物合成酶系统具有刺激作用)；有的是抑制了某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；有的是降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成，如在四环素发酵中添加硫氰化苄，可降低菌在三羧酸循环中某些酶活力，而增强戊糖代谢，使之利于四环素的合成；有的可改变发酵液的物理性质，改善通气效果，如加入聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺等水溶性高分子化合物或加入某些表面活性剂后改善了通气效果，进而促进发酵单位提高；有的可与抗生素形成复盐，从而降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成，如在四环素发酵中加入N,N-二苄基乙烯二胺(DBED)与四环素形成复盐，促使发酵向有利于四环素合成的方向进行。
表3-36　抗生素的抑制剂

　　氨基酸发酵易于发生的问题，一是谷氨酸发酵时噬菌体引起的异常发酵，由于噬菌体有宿主专一性，现在的措施是交替更换菌种或选用抗噬菌体菌株，但噬菌体也可以发生宿主范围突变，因此也有采用添加氯霉素、多聚磷酸盐、植酸等防止；二是赖氨酸发酵等营养缺陷型菌株易发生回复突变，现在发酵时已采用定时添加红霉素而解决。
　　在发酵过程中添加促进剂的用量极微，选择得好，效果较显著，但一般来说，促进剂的专一性较强，往往不能相互套用。
第五节　淀粉水解糖的制备
　　淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子，大多数的微生物都不能直接利用淀粉，如氨基酸的生产菌、酒精酵母等。因此，在氨基酸、抗生素、有机酸、有机溶剂等的生产中，都要求将淀粉进行糖化，制成淀粉水解糖使用。不管是淀粉水解糖中的葡萄糖或是糖蜜中的蔗糖，它们都是菌体发酵最基本的碳源以及菌体生长和繁殖的能量及碳素来源，也是组成产物分子结构的碳架成分。
　　在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外，根据水解条件的不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其他一些二糖、低聚糖等复合糖类。除此以外，原料带来的杂质(如蛋白质、脂肪等)以及其分解产物也混入糖液中。葡萄糖、麦芽糖和蛋白质、脂肪分解产物(氨基酸、脂肪酸等)等是生产菌生长的营养物，在发酵中易被各种菌利用；而一些低聚糖类、复合糖等杂质则不能被利用，它们的存在，不但降低淀粉的利用率，增加粮食消耗，而且常影响到糖液的质量，降低糖液中可发酵成分。在谷氨酸发酵中，淀粉水解糖液质量的高低，往往直接关系到谷氨酸菌的生长速度及谷氨酸的积累。因此，如何提高淀粉的出糖率，保证水解糖液的质量，满足发酵高产酸的要求，是一个不可忽视的重要环节。能够作为谷氨酸发酵工业原料的水解糖液，必须具备以下条件。
　　① 糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖浓度的要求。
　　② 糖液洁净，是杏黄色或黄绿色，有一定的透光度。水解糖液的透光度在一定程度上反映了糖液质量的高低。透光度低，常常是由于淀粉水解过程中发生的葡萄糖复合反应程度高，产生的色素等杂质多，或者由于糖液中的脱色条件控制不当所致。
　　③ 糖液中不含糊精。糊精并不能被谷氨酸菌利用，它的存在使发酵过程泡沫增多，易于逃料，发酵难以控制，也容易引起杂菌污染。
　　④ 糖液不能变质。这就要求水解糖液的放置时间不宜太长，以免长菌、发酵而降低糖液的营养成分或产生其他的抑制物，一般现做现用。
　　目前，由淀粉经水解制备葡萄糖(或葡萄糖液)除了应用于氨基酸发酵外，制药工业(如抗菌素类的发酵)，在葡萄糖的生产中也普遍使用，而且也发展成为一门独立的工业——葡萄糖工业。
淀粉水解糖的制备方法
　　可以用来制备淀粉水解糖的原料很多，主要有薯类、玉米、小麦、大米等含淀粉原料。根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有下列三种。
　　⒈ 酸解法(acid hydrolysis method)
　　酸解法又称酸糖化法。它是以酸(无机酸或有机酸)为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。
　　用酸解法生产葡萄糖，具有生产方便、设备要求简单、水解时间短、设备生产能力大等优点。但由于水解作用是在高温、高压及一定酸度条件下进行的，因此，酸解法要求有耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备。此外，淀粉在酸水解过程中所发生的化学变化是很复杂的，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖的损失而使淀粉的转化率降低。酸水解法对淀粉原料要求较严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低，这些是酸解法存在的待解决的问题。
　　⒉ 酶解法(enzyme hydrolysis method)
　　酶解法是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。利用α-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化(1iquification)。利用糖化酶将糊精及低聚糖进一步水解转化为葡萄糖，这个过程在生产中称为糖化(saccharification)。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故酶解法又有双酶(或多酶)水解法之称(double-enzyme hydrolysis method)，优点如下。
　　① 采用酶法制备葡萄糖，酶解反应条件较温和。因此，不需耐高温、高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易运作。
　　② 微生物酶作用的专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率(出糖率)高。
　　③ 可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。
　　④ 用酶解法制得的糖液颜色浅，较纯净，无异味，质量高，有利于糖液的充分利用。
　　但酶解反应时间较长(48 h)，需要的设备较多，需要具有专门培养酶的条件，而且酶本身是蛋白质，易引起糖液过滤困难。但是，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶制剂的大量生产，酶法制糖逐渐取代酸法制糖已是淀粉水解制糖的一个发展趋势。
　　⒊ 酸酶结合法(acid-enzyme hydrolysis method)
　　酸酶结合水解法是集中酸法和酶解法制糖的优点而采用的结合生产工艺。根据原料淀粉性质可采用酸酶水解法或酶酸水解法。
　　⑴ 酸酶法　是先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解成葡萄糖的工艺。如玉米(corn)、小麦(wheat)等谷类原料的淀粉，淀粉颗粒坚硬，如果用α-淀粉酶液化，在短时间内作用，液化反应往往不彻底。工厂采用将淀粉用酸水解到一定的程度(用DE表示，一般为10～15)，再降温中和后，用糖化酶进行糖化，此法的优点是酸液化速度快，糖化时可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高。
　　⑵ 酶酸法　将淀粉乳先用α-淀粉酶液化到一定的程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。有些淀粉原料，颗粒大小不一(如碎米淀粉)，如果用酸法水解，则常使水解不均匀，出糖率低。生产中应用酶酸法，可采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸解法要高，生产易控制，时间短，而且酸水解时pH值可稍高些，以减轻淀粉水解副反应的发生。
　　总之，采用不同的水解制糖工艺。各有其优点和存在的问题，但从水解糖液的质量和降低糖耗、提高原料利用率方面来考虑，酶解法最好，其次是酸酶法，酸解法最差。从淀粉水解整个过程所需的时间来看，酸解法最短，酶解法最长。表3-37为酸解法与酶解法糖液质量的比较。
表3-37　酸解法与酶解法（双酶法）糖液质量比较

淀粉酸水解原理
　　淀粉是由数目众多葡萄糖单位[(C6H10O5)n]经由糖苷链缩合脱水而成的多糖。用淀粉质原料生产葡萄糖，很早以来，人们就采用无机酸(通常用盐酸)为催化剂，在高温高压条件下使淀粉发生水解反应，转变为葡萄糖。
　　⒈ 淀粉水解过程中的变化
　　淀粉酸水解反应过程的变化是复杂的。淀粉的颗粒结构被破坏，α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键被切断。这种作用是在酸催化下进行的。水解过程中不仅有葡萄糖，尚有其他的二糖、三糖、四糖等更高的糖，只是水解反应的总趋势是大分子向小分子转化，即淀粉→糊精→低聚糖→葡萄糖。淀粉水解的中间产物糊精，是若干分子大于低聚糖的碳水化合物的总称，具有还原性、旋光性，能溶于水，不溶于酒精，因分子大小的不同，糊精遇碘可呈不同的颜色。随着淀粉水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加，糖液的甜味越来越浓。这是由于生成的葡萄糖、麦芽糖及低聚糖等具有还原性基团。当DE值超过60时，由于葡萄糖的复合分解反应产生其他有味物质(如龙胆二糖有苦味)及色泽加深。

　　参与淀粉水解反应的物质，除淀粉本身以外，还有水和无机催化剂，反应进行的速度理应取决于这三种物质。无机酸是催化剂，其氢离子对于反应具有催化作用，但是在反应过程中并不消耗，酸的浓度应该不变化。水解实际上是淀粉分子与水分子之间的双分子反应，反应进行的速度取决于两者的浓度。但在水解情况下，淀粉乳浓度一般较低，水的量较大，虽有一部分水参与反应，但是水的量变化很少，不影响反应速度，于是水解的速率只决定于淀粉的浓度，反应则属于单分子反应的一级化学反应类型。
　　⒉ 淀粉制糖过程考察指标
　　⑴ 葡萄糖的理论收率　淀粉经完全水解生成葡萄糖可以用下面的反应式来表示。从该化学反应式可知，由于水解过程中水参与了反应，产物有化学增生，淀粉转化为葡萄糖的理论收率为：

　　⑵ 实际收率　从理论上讲，淀粉水解时可达到完全水解的程度，但是由于水解时存在复合、分解等一系列副反应以及生产过程中的一些损失，葡萄糖的实际收率不能达到理论收率，而仅有100％左右。葡萄糖的实际收率可按下式计算。

　　⑶ 淀粉转化率　淀粉转化率的计算可按下式进行。

　　⑷ 葡萄糖值——DE值(dextrose equivalent value)　工业上用DE值(也称葡萄糖值)表示淀粉糖的含糖量，液化液或糖化液中的还原糖含量(所测得的糖以葡萄糖计算)占干物质的百分率为DE值。

　　⑸ DX值　糖化液中葡萄糖含量占干物质的百分率为DX值。

　　不管哪种方法制得水解糖，必须达到一定的质量指标，方能满足微生物生产产品的需要。因为，淀粉水解糖是生产菌的主要碳源，它的质量好坏直接影响发酵，关系到产品产率的高低。因此，应合理选择水解工艺，制定相应的水解工艺条件，提高葡萄糖的质量和得率。

第六节　糖蜜原料

　　糖蜜是很好的发酵原料，用糖蜜原料发酵生产，可降低成本，节约能源，简化操作，便于实现高糖发酵工艺，有利于产品得率和转化率的提高。糖蜜原料中，有些成分不适用于发酵，所以在使用糖蜜原料时，可先进行处理，以满足不同发酵产品的需求。
一、糖蜜原料的分类
　　生物发酵工业所用的糖蜜，主要是指制糖工业上的废糖蜜(waste molasses)，它是甘蔗糖厂或甜菜糖厂的一种副产品。糖蜜是一非结晶糖分，本身含有相当数量的发酵性糖，因此是生物工业大规模生产的良好原料。
　　根据来源不同，糖蜜分为甘蔗糖蜜(cane molasses)、甜菜糖蜜(beet molasses)和高级糖蜜(high test molasses)等。甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料糖厂的一种副产品，它的产量约为原料甘蔗的2.5％～3％，甘蔗糖蜜中含有30％～36％的蔗糖和20％转化糖。甜菜糖蜜是甜菜为原料糖厂的一种副产品，它的产量约占甜菜量的3％～4％，含蔗糖5％，转化糖1％。高级糖蜜是指甘蔗榨汁(糖浆)加入适量的硫酸或用酵母转化酶(invertase)处理，制成转化糖，该糖蜜由于提高了溶解度，可使糖浓度提高70％～85％。此外还有两种废糖蜜，一种是精制粗糖时，所分离出的糖蜜，称为粗糖蜜(raw sugar molasses)；另一种是葡萄糖工业上，不能再结晶葡萄糖的母液，称为葡萄糖蜜(glucose molasses)。
二、糖蜜原料的性质和组成
　　糖蜜的外观是一种黏稠、黑褐色、呈半流动状的物体，pH值5.5左右，相对密度1.43。糖蜜的组成，因制糖原料的种植、贮藏及加工方法等条件的不同而有差异。其一般组成见表3-38。各种糖蜜中的糖类的组成也不相同。除含有发酵性的糖分外，还含有胶体物质、灰分、维生素、氨基酸。甘蔗糖蜜中的生物素较甜菜糖蜜中高。
表3-38　糖蜜的一般组成

三、糖蜜的预处理
　　糖蜜的预处理，包括澄清和脱钙处理，对生物素缺陷型菌体生产来说(如谷氨酸)，还应该进行脱生物素处理，一般所说的预处理是指澄清处理和脱钙处理。
　　⒈ 糖蜜澄清处理的目的
　　糖蜜中由于含有大量的灰分和胶体，不但影响菌体生长，也影响产品的纯度，特别是胶体的存在，致使发酵中产生大量的泡沫，影响发酵生产。因此，应进行适当的澄清处理。一般有加酸法、加热加酸法和添加絮凝剂澄清处理法几种。
　　⒉ 谷氨酸发酵中糖蜜的预处理
　　目前，谷氨酸发酵中，使用生物素缺陷型菌株，发酵培养基中的生物素为5 μg／L左右，而糖蜜中特别是甘蔗糖蜜中的生物素含量为1～10 μg／g，显然不适合谷氨酸的发酵。因此，在使用糖蜜原料发酵生产谷氨酸时，必须想方设法降低糖蜜中生物素含量。一般有活性炭处理法、树脂法以吸附生物素；用化学药剂拮抗生物素或使用其他营养缺陷型菌株(如氨基酸缺陷型、甘油或油酸缺陷型、精氨酸缺陷型等菌株)。还可能通过改进生产工艺如添加青霉素，改变细胞的渗透性，即使培养基中生物素含量高，细胞膜仍成为谷氨酸向外渗透模式，因而不影响谷氨酸产量。

思考题

⒈ 何为营养物质？微生物的营养物质有哪几类？功用如何？
⒉ 什么叫碳源?试从元素水平、分子水平和培养基原料水平列出微生物的碳源谱。
⒊ 什么叫氮源?试从分子水平和培养基原料水平列出微生物的氮源。
⒋ 何为生理酸性盐和生理碱性盐？
⒌ 何为原养型微生物？何为营养缺陷型微生物？
⒍ 微生物有哪些营养类型？各自特点如何？工业微生物主要为哪种类型？
⒎ 什么叫能源?试以能源为主、碳源为辅对微生物的营养类型进行分类。
⒏ 比较营养物质的四种跨膜输送形式。
⒐ 什么叫生长因子?它包括哪几类化合物?微生物与生长因子的关系有哪几类?试举例加以说明。
⒑ 何为培养基？有哪些类型？富集、选择、鉴别培养基有何共性？有何区别？
11. 测定微生物生长的方法有哪些？原理如何？
12. 单细胞微生物如何生长规律如何？在发酵工业上怎样根据生长曲线缩短发酵周期、增加产量？
13. 什么叫碳氮比? 培养基中各营养要素的含量间一般遵循何种顺序? 培养基的碳氮比对菌体的生长和产物形成有何影响？
14. 何为分批培养？何为连续培养？试分析恒化器处于稳定状态的条件。
15. 何为同步培养物？有哪些获得方法？
16. 培养基的配制原则有那些？配制时应注意哪些问题？
17. 试比较各种水解糖制备方法的优缺点。

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