基因工程技术在制药领域的应用前景及产业化趋势

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现代生物技术，又称生物工程，是利用生物有机体（从微生物直至高等动物）或其组成部分（器官、组织、细胞等）发展新工艺或新产品的一种科学技术体系。
生物工程主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和发酵工程等5个部分。以重组DNA为核心的现代生物技术的创立和发展，为生命科学注入了新的活力，它所提供的实验方法和手段极大地促进了传统生物学科如植物学、动物学、遗传学、生理学、生物医学等的发展。同时，生物技术目前也已被广泛地应用于医药、食品、化学、农业及环保等领域，为这些行业带来了一场新的技术革命。

现代生物技术的发展仅20余年，但它在生命科学研究和产业化方面已产生了巨大的影响，但这仅仅是个开始，生物技术的发展和应用仍方兴未艾。

基因工程即重组DNA技术，是指对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。

基因工程彻底改变了传统生物科技的被动状态，使得人们可以克服物种间的遗传障碍，定向培养或创造出自然界所没有的新的生命形态，以满足人类社会的需要。

蛋白质工程也称“第二代基因工程”。蛋白质工程主要包括通过基因工程技术了解蛋白质的DNA编码序列、蛋白质的分离纯化、蛋白质的序列分析和结构功能分析、蛋白质结晶和蛋白质的力学分析、蛋白质的DNA突变改造等过程。

蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能找到了新途径，推动了蛋白质和酶的研究，为工业和医药用蛋白质（包括酶）的实用化开拓了美妙的前景。

细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种和保存濒危珍稀物种。细胞工程主要包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段重组等。

体细胞融合是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。

细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重要的意义。克隆技术便是细胞核移植的一个最为典型的应用。

细胞器的摄取主要是指叶绿体和线粒体的摄取。如用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；用抗药型草履虫的线粒体植入其他草履虫细胞，使后者获得抗药性。

染色体片段重组是利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体等方法，获得新的染色体组合。

酶是生物体内的一种具有新陈代谢催化剂作用的特殊蛋白质，它们可特定地促成某个反应而自身却不参与反应，并具备反应效率高、反应条件温、反应产物污染小、能耗低以及反应易于控制等优点。

酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。

发酵工程是指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物的反应器中生产有用物质的一种技术系统。当前的医用和农用抗生素绝大部分是发酵的产品，此外发酵工程产品还包括氨基酸、工业用酶等，人们日常生活中广泛使用的味精、维生素B2等也是发酵工程的产品。

基因工程的操作步骤

基因工程一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA（质粒和病毒DNA称作载体）；三是把重组DNA引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。首先，要把所需基因——目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自70年代以来，人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”，其中许多“分子剪刀”的特定识别切点已被弄清。有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。由于限制性内切酶的发现，阿尔伯、史密斯和内森斯共享1978年诺贝尔生理和医学奖。

DNA的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。从此，DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。

把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。

基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一种理想的载体是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。

把目的基因装在运载体上，运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步。一般情况下，转化成功率为百万分之一。为此，遗传工程师们创造了低温条件下用氯化钙处理受体细胞和增加重组DNA浓度的办法来提高转化率。采用氯化钙处理后，能增大体细胞的细胞壁透性，从而使杂种DNA分子更容易进入。目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。
　　目的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体内能表达产生所要蛋白产物。生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所需目的基
因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的基因的方法是人工合成。随
着技术的进步，已有用于自动测定DNA顺序的专门仪器和自动合成DNA仪器。还有一种基因合成方法是模板合成。基因工作指令的传递是按照“DNA-
RNA-蛋白质”这一方向进行的，相反的信息传递即由RNA-DNA也存在。基因模板合成法就是先以信使RNA为模板，反向转录出一条DNA单链，再以互
补的方式加倍成DNA双链。用这种方法人们已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。

载体：目的基因片段很难直接转入生物体细胞，而且由于它自身常无DNA复制所需信息，在细胞分裂时不能复制给子细胞，就会丢失，所以人们要把它连在一些能独立于细胞染色体之外复制的DNA片段上，这些DNA片段就叫载体。常用的载体有质粒和病毒。当然载体还有其它作用，如促进目的基因转化、表达等。人们对天然质粒及病毒进行了一系列改造，如加上耐药性基因片段等，提高基因的转化、筛选、表达效率。

限制性内切酶： 在细菌内存在的一类能识别并水解外源DNA限制性内切酶，它具有极好的专一性，能识别DNA上的特定位点，将DNA的两条链都切断，形成粘性末端或平末端。DNA经限制性内切酶切割后产生的具有碱基互补单链的末端称为粘性末端。限制性内切酶的生物学功能在于降解外面侵入的DNA而不降解自身细胞的中的DNA，因自身DNA的酶切位点经修饰酶的甲基化修饰而受到保护。限制性内切酶较为稳定，常用的约100多种，并已大多转化为商品。限制性内切酶在分析染色体结构、制作DNA的限制酶图谱、测定较长DNA序列以及基因的分离、基因的体外重组等研究中是
不可缺少的重要工具酶。

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转化：重组DNA进入受体的过程叫“转化”，得到重组DNA的细胞叫“转化细胞”。目的基因难以直接送进受体细胞。因为地球上的生物都是长期历史进化的产物，都有保卫自身不受异种生物侵害和稳定地延续自己种族的功能。如果外来的DNA闯进受体细胞，受体细胞就会把它“消灭”。当外来的DNA进入大肠杆菌时，大肠杆菌内部的内切酶就会使其“粉身碎骨”。因此，目的基因的直接导入往往不通。在这种情况下，生物工程师们就要采用DNA重组技术。首先将目的基因与质粒经过内切酶的“裁剪”，然后靠连接酶的作用，将目的基因和质粒（或病毒DNA）重新组合起来形成重组DNA。重组DNA就能在质粒（或病毒DNA）的“带领”下进入受体细胞。

一、基因工程制药的最新进展

基因工程开创制药工业新门类

现代生物技术是通过生物化学与分子生物学的基础研究而快速发展起来的。医药生物技术起步最早、发展最快，目前世界已有2000多家生物技术公司，其中70%从事医药产品的开发。美国已批准30多个生物技术药品上市，还有143种生物技术药物和疫苗正在进行临床试验，另有472种处于不同研究阶段。有资料表明，从1982年重组人胰岛素上市至1991年10年间仅批准该类药品用于治疗21个病种，而近3年新批准用于治疗的品种已达13个，说明生物技术药品的审评速度加快，生物技术工业总体日趋成熟，正在由风险产业变成以商业为动力，以市场为中心的产业。

应用生物技术已有可能产生几乎所有的多肽和蛋白质，基因工程技术的应用已使新药研究方法和制药工业的生产方式发生重大变革。

基因工程药物的研究进展

近十几年来，在利用生物技术制取新药方面取得了惊人的成就，已有不少药物应用于临床。例如人胰岛素、人生长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生成素（Epo）、GM－集落刺激因子（GM－CSF）、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素－2及白介素－11等。正在研究的有降钙素基因相关因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种。随着生物技术药物的发展，多肽与蛋白质类药物的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给生物制剂带来了新的挑战。在实际应用中，基因工程药物受到一定限制，如口服应用时生物利用度低，会受到消化酶的破坏，在胃酸作用下不稳定，在体内半衰期较短等，因此只能注射给药或局部用药。为了克服这些缺陷，已开始改为合成这些天然蛋白质的较小活性片段，即所谓“多肽模拟”或“多肽结构域”合成，又叫“小分子结构药物设计”。这类药物可口服，有利于由皮肤、粘膜给药，用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、变态反应性疾病、风湿性关节炎等，其制造成本也更低。这种设计思想也已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物设计属于第二代结构相关性药物设计，所设计的分子能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用。

在给药方式的研究方面，对注射用溶液和注射用无菌粉末 （目前上市的多肽蛋白质类药物多为此种剂型），除了继续改进其稳定性外，还通过一些其他技术手段，研制出了化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。在非注射途径的给药系统，即包括鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。


第一代和第二代基因工程药物

第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。应用基因工程技术去扩大这类多肽蛋白质的产量以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要，主要是以蛋白质激素类为代表的，如人胰岛素、胰高血糖素、人生长激素、降钙素、生长激素(somatropin)及α-EPO(Epoetinalfa)等。第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白的生理活性，应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质，以超正常浓度剂量供给人体，以激发它们的天然活性作为其治疗疾病的药理基础，主要是以细胞生长调节因子为代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN，γ-IFN和tPA等。　

蛋白质工程药物

应用蛋白质工程技术已获得多种自然界不存在的新型基因工程药物，如CD4，IL-2与毒素结合的杂合蛋白和PIXY321等。

对表达产物的后修饰也是改善蛋白质工程药物药理作用的有效手段。如PEG修饰能有效地改善多肽蛋白质类药物的免疫原性，增加稳定性，延长体内半衰期，减少毒副作用等。PEG-腺苷脱胺酶已投放市场，PEG-天冬酰胺酶，PEG-IL-2，PEG-SOD，均已进入临床。


应用重组DNA技术表达人源性抗体或将抗体小型化(如Fab抗体，单链抗体、单域抗体，分子识别抗体等)，与非人源化抗体和完整抗体相比，其免疫原性弱，穿透力强，表达效率高。所以人源化抗体药物和小型化抗体靶向药物正成为肿瘤治疗，自身免疫性疾病，器官移植排斥和艾滋病防治药物的又一研究热点。

基因工程制药的技术路径

利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。 从1982年重组胰岛素批准上市以来，现已有近40种基因工程蛋白质药物投放市场，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病、外周神经病、矮小症、心血管病、糖尿病、不孕症等疑难病。近年来，利用转基因植物生产基因工程疫苗和利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物的研究也取得重大进展。


1、转基因植物基因工程疫苗

1990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马岭薯、蕃茄、香蕉等植物。

2、转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程药物

利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低，故近年不少研究者从事转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究。乳腺生物反应器生产基因工程药物的基本方法是：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。

1988年开始在大哺乳动物乳腺生物反应器中表达基因工程药物以来，已在以下动物的奶汁中生产出一些人类蛋白质药物：牛奶中有抗凝血酶、纤维蛋白原、人白血清蛋白、胶原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C等，山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗体，绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C，猪奶中亦有蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。

乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究已取得了一些成功经验，但离商业化生产还有距离。

二、中国基因工程新药简介

外用重组人表皮生长因子衍生物

深圳华生元基因工程发展有限公司开发的外用重组人表皮生长因子衍生物喷剂“依济复”，日前获得国家一类新药证书。这种喷剂将显著促进创伤愈合，大大提高临床治疗水平，是中国基因工程制药领域取得的又一项新成果。

医学研究表明，人表皮生长因子（ｈＥＧＦ）是一种广泛存在于体内的小分子多肽，以自分泌和旁分泌方式分布于体内，多类表皮细胞群的生长对ＥＧＦ的刺激能作出灵敏反应。实验证明，极微量的ｈＥＧＦ可刺激上皮细胞、成纤维细胞和角化细胞的增殖，促进核酸、蛋白质和羟脯氨酸等
的合成等。

外用重组人表皮生长因子衍生物喷剂（ｒｈＥＧＦ）采用ＤＮＡ重组技术，构建与完善了ｈＥＧＦ大肠杆菌分泌表达细统，在结构和生物学活性等方面与内源性ｈＥＧＦ高度一致。它通过与细胞膜上的受体结合而产生生物学效应，从而激活核内重要基因，调控细胞增殖和激活蛋白质合成。
专家认为，ｒｈＥＧＦ可显著促进创面愈合，在普通外科、胃肠道溃疡防治、角膜损伤修复等方面有广阔的应用前景。

人降钙素基因相关肽脂质体片剂

由北京沃华生物大分子应用开发有限公司发明的专利技术，已申报14个国家和地区专利。与其它活性多肽物质一样，降钙素基因相关肽是易于氧化、水解的不稳定生物活性物质，在人体内，特别是在肝、肺等组织内缓慢被降解，半衰期短仅9分钟，所以不能直接作为药品。利用脂质体载体嵌入技术，在成功完成了人降钙素基因相关肽脂质体注射液的基础上，根据临床的需求，进行了该药的剂型改革试验，制备出符合临床要求、患者易于接受的口服片剂，为多肽类药物上市奠定了良好的基础。该片剂具有疗效确切、稳定性好、缓释长效、用药剂量小（pg量）、无毒副作用等特点。对局灶性脑梗塞和全脑缺血都有确切的保护作用，可以做为预防和治疗该病的有效药物。

生物免疫调节剂

5月中旬，湖南九芝堂股份公司开发的新药——斯奇康注射液拿到新西兰，按照国际通行的GCP标准进入临床实验研究。著名国际呼吸病专家贝斯理教授认为，运用生物免疫调节治疗哮喘、慢性支气管炎等呼吸病，国际医学界尚处在动物试验阶段，而中国已经有了大批量临床成功应用的制剂，这是医学界的一大突破。湖南九芝堂公司进行了长达12年的深度开发，采用卡介菌经热酚法提取多糖核酸，配以灭菌生理盐水制成了人体肌肉注射液。经首都医科大学、同济医科大学等30多家医院临床应用证实，该注射液可明显调节人体自身免疫水平，无毒副作用禁忌。该新药已经中国生物制品检定所检定并进入了95版生物制品试行规程，正式命名为卡介菌多糖核酸，取商品名为斯奇康。


降血压肽

一种从牛奶中分离出的、可规模化工业生产的、具有高降血压活性的多肽物质，已由广州市轻工研究所研制开发成功，动物实验已显示出其具有起效时间快、持续时间长、对正常血压无影响的特点，人体临床应用研究正在开展中。

降血压肽是指一类具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同，但都具有类似的降压功能。

ACE抑制肽广泛存在于各种食物蛋白中，例如牛奶、玉米、明胶以及发酵乳中都有不同的蛋白来源。

合成ACE抑制剂作为药品已在临床治疗高血压中获得成功，而从天然食物蛋白中分离ACE抑制肽，虽然降血压效果不及合成药物强烈，但它对正常血压无影响的特点和来自天然的安全性吸引了众多研究者。据悉，日本从鱼类中获得的降血压肽已经商品化。

另外，利用来自天然食物蛋白的ACE抑制肽开发具有调节血压作用的保健食品，通过长期服用而达到预防、控制、缓解和辅助治疗高血压的目的，也不失为一条安全有效的途径。