生物发酵工程在医药研究和生产中的应用(

gl19860312

几十年来，生物技术在医药领域的许多方面取得了巨大的进展.如在西药中利用传统发酵工程生产抗生素、酶制剂以及β-胡萝卜素等；利用转基因技术生产干扰素、胰岛素、生长因子等几十种新药和疫苗.在传统中药材中，细胞工程和发酵工程应用有了一定的进展，基因工程也正在兴起.本文着重综述了微生物和植物细胞的发酵工程在医药研究和生产中应用的最近进展.  

1　微生物发酵工程与医药  

1.1　抗生素的微生物合成  

　　     随着科学技术的发展，抗生素来源不再仅限于微生物，已扩大到动植物.它不仅可用于治疗细菌感染，而且可用于治疗肿瘤以及由原虫、病毒和立克次体所引起的疾病，有的抗生素还有刺激动植物生长的作用.  

　　    自1929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素.在近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发酵法大量生产和广泛应用的多达百余种.  

　　     一个好的抗生素应具有较广的抗菌谱外，还应具有较好的选择性，不产生过敏和耐药性，有高度的稳定性，收率高，成本低，适于工业生产.目前生产和应用的抗生素还不能完全满足以上要求，寻找新的抗生素仍然是很重要的任务.现在以抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗原虫、广谱和抗耐药菌的抗生素为主要研究方向，已成功地建立了用于治疗艾滋病，抗老年性痴呆症，消除肥胖症，控制糖尿病并发白内障，抑制前列腺肿大的抗生素的筛选模型，估计近年内可取得一系列成功.因此，现在利用发酵技术生产的“抗生素”可以把微生物代谢产生的对人类疾病的预防和治疗有用的物质都包括进去.  

1.2　维生素类药物的微生物生产  

　　    维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必需.va的前体β-胡萝卜素及vc和ve均为抗氧化剂，能保护人体组织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗癌、抗心血管疾病和白内障等功能.  

　　   国内用真菌三孢布拉霉生产β-胡萝卜素的产量达2.0  g．l-1，国外已达到(3～3.5)  g．l-1.粘红酵母、布拉克须霉、丛霉等真菌也具有生产β-胡萝卜素的能力.除真菌外，如球型红杆菌、瑞士乳杆菌等某些细菌也具有发酵生产类胡萝卜素的能力.vc的微生物发酵法早已取得重要突破，利用“大小菌落”菌株混合培养生产vc的工艺已经成熟，进入产业化.目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将vc的收率提高到80%以上，生产周期比传统工艺缩短1/3.日本研究人员发现一种纤细裸藻能同时生产vc、ve和β-胡萝卜素，藻体生物量产量可达每升培养液20  g，从中提取vc和ve量为60  mg．l-1，β-胡萝卜素40  mg．l-1；生产效率比原有培养方法提高1倍以上，生产能力优于绿藻.vd的前体麦角固醇有可能利用酵母菌来发酵生产，通过对不同种属酵母菌的麦角固醇含量的测定分析发现，最高含量可达细胞干重的6%，最低的仅0.3%.莫斯科大学的研究者采用杂交方法选育到麦角固醇含量高达2.7%的酵母高产菌.通过优化培养条件，有目的地调节关键基因的表达，以获得高产菌株与培养条件的双重优化，麦角固醇的微生物产量可望进一步提高.  

1.3　多烯脂肪酸的微生物生产  

　　    γ-亚麻酸(gla)是人体不能合成而又必需的多烯脂肪酸缺乏时会导致机体代谢的紊乱而引起多种疾病，如高血压、糖尿病、癌症、病毒感染以及皮肤老化等.因此，体内补充gla已成为治疗疾病和抗衰老的重要手段.gla在体内转化为二高γ-亚麻酸(dgla)和花生四烯酸(aa)，两者再分别合成前列腺素类物质而发挥对人体生理功能的重要调节作用.深黄被孢霉可合成gla，李明春等采用紫外线照射法对原生质进行诱变处理，大大提高了gla的产量.二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)在海洋冷水鱼中含量颇丰，是很有价值的医药保健产品，有“智能食品”之称.日本在冷海水域找到的细小球藻中epa含量高达总油量的99%.而等鞭藻的dha含量为5.4  mg．g-1干藻体.台湾省的陈俊兴等也获得类似结果，dha产量为6.95  mg．l-1，若进行低温和暗处理，藻体内dha的含量可增加1倍.除海洋微细藻外，海洋中还有一种繁殖力很强的网粘菌sr21，其干菌体生物量含脂质次价高70%，其中dha含量为30%～40%，可通过发酵生产dha，每升培养液产量为4.5  g，该菌dha含量与海产金鲶鱼或鲣鱼眼窝脂肪相近.而美国的一种标本菌株atcc34304生产dha能力只有0.6  g．l-1，比网粘菌的dha产量低得多.高产epa和dha微生物的发现将为其大量生产开辟新途径.最近，杨革等报道了拉曼被孢霉生物合成花生四烯酸.  

1.4　医用酶制剂的发酵生产  

　　   目前，我国每年约有60万人死于冠心病，约120万人死于脑梗塞、脑溢血，而美国每年约有15万人死于中风，约80%的病例是由于阻止血液流向大脑的血凝块引起而导致突发性死亡.近年来，除链激酶、链道酶、尿激酶、葡萄糖激酶、金葡激酶、组织型纤溶酶激活剂等之外，蚓激酶也得到开发.它们都是溶血栓的有效药物，已进入临床实用.微生物生产的溶栓酶存在其优越性:只要有高产菌种，生产工艺条件确定以及产品的有效性或高效性，即可实现规模生产.最近，天津轻工业学院研究人员正在开展新的溶血栓酶研究.他们从我国十酒药中分离到一种根霉，能生产血栓溶解酶，溶血栓活性高，且专一性强，对血细胞无分解作用，而且低毒、价廉.此外，日本从食品中分离到天醅激酶和纳豆激酶，能在血液中停留10  h，显示出对血纤溶蛋白的强烈分解活性，且无任何副作用.  

gl19860312

1.5　紫杉醇的微生物合成  

　　    紫杉醇主要是由红豆衫属树种产生的一种二萜类抗癌新药.1983年以来的临床研究表明，紫衫醇对人体抗药性卵巢癌、乳腺癌及黑素瘤等有突出疗效，是近15年来发现的最重要的抗癌药物.临床上用的紫衫醇至今仍来自天然红豆杉树皮，其含量占树皮干重的万分之二，现在红豆杉树资源严重缺乏，微生物产生发酵就是开辟紫杉醇新来源的途径之一.1993年stierle等首次报道了真菌安德烈紫杉菌通过发酵也能产生紫杉醇，该菌株连3周内发酵液中每升含紫杉醇几纳克.最近，他们又从西藏红豆杉细枝中分离到20世纪末1株小孢盘多毛孢菌，其发酵水平略高(每升几纳克)，我国北京大学研究人员也获得类似的研究成果.美国华盛顿大学研究人员运用现代生物技术，将紫杉醇合成酶基因转入紫杉醇产生菌中，有可能建构高产紫杉醇的“工程菌”，预计此工程紫杉醇的产量比天然真菌提高几千倍.澳大利亚研究人员从红松类松树皮中发现一种丝状菌体“树木菌”，产生的化合物具有类似于紫杉醇的抗癌特效.  



2　细胞组织培养与药物  

2.1　细胞培养技术生产中药有效成份  

　　    中药的有效成份主要是细胞次生代谢产物，因此利用培养细胞代谢产物的研究是生物技术在中药生产中应用较早的一个方面.目前已经从400多种植物建立了组织和细胞培养物，从中分离出600多种代谢产物，其中40多种化合物在产量上超过或等于原植物，为利用细胞培养技术工业化生产医药奠定了基础.  

　　    人们通过筛选高产细胞系，改进培养条件和技术，设计适合植物培养细胞的发酵罐等手段，对烟草、紫草、长春花、丹参、红豆杉、三尖杉、洋地黄、人参、三七、西洋参、三分三、毛地黄、茜草、黄连和彩叶紫苏的多种植物细胞进行了大规模悬浮培养的试验，以生产烟碱、紫草宁、长春藤碱、丹参酮、紫杉醇、三尖杉酯碱、洋地黄碱、人参皂、三七、西洋参、三分三、毛地黄碱、茜草素、黄连素和紫苏素等药物.发酵罐规模已达到(10～75)  l，其中紫草宁、茜草素和人参皂已商业化.近年来，紫杉醇含量已经比原植物提高了100多倍，达到153  mg．l-1，而且美国phyton  catalytic公司已在德国diversa进行了75  t发酵罐实验.日本和我国的学者们正在对三尖杉细胞的悬浮培养条件进行优化，提高三尖杉酯碱的含量.华中理工大学开展了红豆杉细胞培养技术的系统研究，取得显著的进展.上海中医药大学筛选出具有高转化率的洋地黄细胞系，并进行了毛花洋地黄植物与培养细胞之间羟化能力关系的基础研究.中国药科大学对人参进行了10  l规模的细胞培养试验，生产出我国传统中药材生物技术的第一个商品化产物.邢建民等观察了水母雪莲悬浮培养细胞生长和黄酮类活性成份合成的关系.  

2.2　遗传转化器官的培养与药物生产  

　　    由农杆菌感染植物组织形成的“畸形芽”和“毛状根”是继细胞培养后又一重要培养系统.中药许多有效成分的形成与器官分化过程密切相关，而在培养细胞中有效成分不存在或含量极少.与细胞培养相比，毛状根培养有明显优点：生长速度快、分枝多，弱向地性；毛状根处于器官化水平，其生理生化、遗传特性稳定，具有稳定的次生代谢物合成能力，毛状根培养系统对根类中药材中有效成分的生产更为重要.目前已在长春花、青蒿、烟草、人参、丹参、紫草、黄芪、甘草、曼陀罗和颠茄等40多种植物建立了毛状根培养系统，同时还建立了烟草、薄荷、澳洲茄、颠茄和马铃薯等植物的畸形芽培养系统，其生长速度有的可以超过毛状根.  

　　   上海中医药大学对黄芪毛状根的大规模培养技术和化学成分与药理活性进行了深入研究，在3  l、5  l、10  l培养器中经21  d培养，有效成分产量可达10  g．l-1(干重)，而且黄芪毛状根中皂甙、黄酮、多糖、氨基酸等含量近似于药用黄芪，其作用效价也与药用黄芪基本一致.他们对丹参毛状根进行培养证实，7种丹参酮不仅存在毛状根中，而且约40%分泌到培养基中.我国从黄花蒿中分离鉴定出的青蒿素是抗疟有效单体，对脑型和抗氯喹性疟疾有特效，成为who推荐产品.刘春朝等利用ri1601质粒转化青蒿叶片筛选的高产系，进行了青蒿毛状根合成青蒿素的培养工艺条件研究，取得较好结果：在优化条件下，经25  d培养，青蒿素产量达223.3  mg．l-1.目前毛状根培养系统的中试装置已达500  l的规模，利用20  t发酵罐生产的人参毛状根已开发成商品投入市场.  

2.3　药用植物组织的离体培养  

　　     自1960年利用组织培养技术将兰花茎尖分生组织进行离体培养，建立无性繁殖系并诱导分化成植株以来，已发现能进行离体分化的植物有千余种，能进行快速繁殖的有数百种，能进行规模化和商品化生产的有近百种.其中有100多种药用植物经离体培养分化成植株，对稀有珍贵中药品种的保存、繁育和纯化具有重要意义.  

　　     利用大规模培养技术进行植物繁殖是继试管繁殖后又一个十分有用的培养技术，1981年矮牵牛发酵罐繁殖后，大规模培养技术取得了巨大进展.目前已进行了草莓、矮牵牛、大岩桐、百合、马铃薯、兰花、唐菖蒲等值物的茎、芽、微小块茎、球茎、体细胞胚、小植物和合成种子的大规模培养试验，培养规模(1～1000)  l，培养时间随培养物的不同而不同.最近报道的甜菊茎500  l大规模培养结果表明，在25  ℃、2000  lux光照、15  l/min通气量的培养条件下，每批培养小植物数量可达20万株.为了使大规模培养的体细胞胚胎处于相同发育期，通过不断过筛、密度梯度离心以及培养的方法基本上解决了胡萝卜体细胞胚胎同步发育的难题，实现了从单细胞到完整植物发育的同步化，为胡萝卜素的生产开辟新途径.最近进行的从生物反应器中培养青蒿小植物生产萜类化合物的尝试，为传统中药的大规模培养提供了先例.  

2.4　生物转化系统与药物生产  

　　    植物培养细胞和微生物具有诸如酯化、氧化、乙酰化、还原化、甲基化、羟基化和羰基化等多种生物转化能力.生物转化实质上是一种酶催化反应.某些植物酶能够催化微生物和化学合成很难进行的立体专一和区域专一的反应，因此进行自由悬浮或固定化细胞的生物转化研究就成为植物生物技术的一个重要研究领域.但是多数微生物转化反应的转化率较低，能够达到工业化和商品化的还不多.德国科学家利用洋地黄培养细胞特定的羟基化能力，将β-洋地黄毒甙转化为临床上使用的强心甙β-甲基地谷新，使用200  l发酵罐可以获得(600～700)  mg．l-1的转化率，德国boehinger  mannhein公司已进行商业化生产的评估.熊果苷是人类皮肤中黑色素合成的抑制剂，是美容产品的重要添加剂.利用毛曼陀罗、长春花或蛇根木的培养细胞进行的生物转化取得了成功，其产量分别达到7.1  g．l-1、9.2  g．l-1和18  g．l-1，已经达到化学合成的产量，有希望进行商业化生产.最近将鬼臼毒转化成它的β-葡萄糖甙也获得成功，转化率达到294  mg。