微生物诱变育种技术概述

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微生物诱变育种技术概述

摘要：概述了微生物诱变育种中常用的方法极其可能诱变机制
关键词：微生物 诱变育种 机制

Summarization of the way of microorganism induced mutation breeding techniques
Li Ling (20040694)
Class 1 of biotechnology in Heilongjiang University
Abstract: the paper summarizes the way of microorganism induced mutation breeding and its possible mutation principle.
Keyword: microorganism, induced mutation breeding, principle.

前言：
微生物常规育种是以自然突变为基础,从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方法。一般情况下,由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用,发生自然突变的几率特别低,一般为10-6~10-10/BP,而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制,所以常规育种时间较长,工作量较大。
自从1927年Miller发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后，人们发现其他一些因素也能诱导基因突变并逐渐弄清了一些诱变因素的机理,为工业微生物诱变育种提供了前提条件.根据育种需要,有目的利用诱变因素,可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状。

正文：
目前,人们用于诱变育种的诱变方法有物理诱变，化学诱变,空间技术诱变和复合诱变四种方法，下面分别对各种诱变方法做一下概述：

一．物理诱变
物理诱变剂主要有紫外线，X—射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。
1紫外线  
我们知道，DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm，因此波长260nm的紫外辐射是最有效的诱变剂.对于紫外线的作用已有多种解释,但研究的比较清楚的一个作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失等[1]。
2γ-射线
γ-射线属于电离辐射,是电磁波.一般具有很高的能量,能产生电离作用,因而能直接或间接地改变DNA结构.其直接效应是,脱氧核糖的碱基发生氧化,或脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键断裂,使得DNA的单链或双链键断裂.其间接效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基,这些自由基与细胞中的溶质分子起作用,发生化学变化,作用于DNA分子而引起缺失和损伤.此外,电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体断裂,形成染色体结构的缺失、易位和倒位等[2].  
3激光
激光在微生物诱变育种方面的研究与开发应用比较晚。激光诱变育种技术研究始于20世纪60年代,经过世界各国40多年的开发应用研究,不仅证明激光和普通光在本质上都是电磁波,它们发光的微观机制都与组成发光物质的原子、分子能量状态和变化密切相关。激光是一种与自然光不同的辐射光,它具有能量高度集中、颜色单一、方向性好、定向性强等特性。激光通过光效应、热效应和电磁效应的综合作用,能使生物的染色体断裂或形成片断,甚至易位和基因重组[3]。
4微波
微波辐射属于一种低能电磁辐射,具有较强生物效应的频率范围在300MHz~300GHz,对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升,从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下,生物体会产生一系列突变效应。因而,微波也被用于多个领域的诱变育种,如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种,并取得了一定成果[4]。
5离子束
离子注入是20世纪80年代初兴起的一项高新技术,主要用于金属材料表面的改性。1986年以来逐渐用于农作物育种,近年来在微生物育种中逐渐引入该技术。离子注入诱变是利用离子注入设备产生高能离子束(40~60keV)并注入生物体引起遗传物质的永久改变,然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。离子束对生物体有能量沉积(即注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量,而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程)和质量沉积(即注入的离子与生物大分子形成新的分子)双重作用,从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。因此,离子注入诱变可得到较高的突变率,且突变谱广,死亡率低,正突变率高,性状稳定[5]。

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二．化学诱变
化学诱变剂主要有烷化剂(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等),天然碱基类似物,氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等嵌入染料。
1烷化剂
烷化剂通常带有1个或多个活性烷基,此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去,使碱基许多位置上增加了烷基,从而在多方面改变氢键的能力。例如EMS被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似,是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。EMS诱发的突变主要通过两个步骤来完成,首先鸟嘌呤的O6位置被烷基化,成为一个带正电荷的季铵基团,从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,代替胞嘧啶,发生转换型的突变;二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化,糖苷键断裂造成脱嘌而后在DNA复制过程中,烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对,导致碱基替换,即G∶C变为A∶T。当然,化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异,但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式。另外，诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应,形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断,产生染色体的缺失。这些DNA结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活,而表现出被掩盖的性状。
另外NTG也是最有效,用得最广泛的化学诱变剂之一.依靠NTG诱发的突变主要是GC—AT转换,另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性(PH5.5)条件下会产生HNO2.虽然HNO2本身就是诱变剂,但在NTG有活性时(PH6~9),它却无诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因.它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的[6]。  
2天然碱基类似物
碱基类似物是与DNA正常碱基结构类似的化合物,能在DNA复制时取代正常碱基掺入并与互补碱基配对。如5-溴尿嘧啶(BU)和2-氨基嘌呤(AP),都能引起AT碱基对转换为GC碱基对。
3氯化锂
氯化锂诱变，普遍认为是它导致AT-GC碱基对的转换或导致碱基的缺失。
4叠氮化物
如叠氮化钠( NaN3)NaN3等电点是pH=4. 18,在pH=3时NaN3溶液中主要产生呈中性的分子HN3,易透过膜进入细胞内,以碱基替换方式影响DNA的正常合成,从而导致点突变的产生。NaN3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。
5抗生素
如平阳霉素(PYM)，PYM是一种抗生素,属于博莱霉素的一类。目前主要作为抗肿瘤药应用于临床,对多种癌症具有较好的疗效。抗生素具有高度选择性,能抑制细胞的生长,其中的大多数对维持生命有重要意义。作为一种新的诱变剂, 平阳霉素能直接作用于DNA,高浓度时可使DNA链断开,低浓度时能抑制连接酶,阻止胸腺嘧啶核苷酸聚合入DNA,故抑制DNA的修复合成，PYM在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。与EMS的诱变特点相近,在某些方面优于EMS,很具有开发和应用前景[7]。
6嵌入染料
如吖啶橙、溴化乙锭(EB)等可插入到DNA碱基对之间的染料,被称作嵌入燃料，也是较强的诱变剂,能造成两条链错位或移码突变。

三．空间技术诱变
近年来，人们利用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器，进行搭载微生物材料的空间诱变育种。通过外层空间特殊的物理化学环境，引起菌种的DNA 分子的变异和重组，从而得到生物效价更高的高产菌种。1987年以来,中国科学院微生物研究所等单位,先后利用卫星搭载了真菌、酵母、放线菌、细菌等30多种微生物菌种,经培殖后观察发现,处理后菌种的性状均产生了一些变异,从中选择培育出了一些能提高抗生素和酶产量的新菌种,现已投产应用。
空间环境导致作物遗传变异的原因尚不完全清楚,一般认为空间诱变的主要因素有以下几点。
1．微重力假说 在卫星近地面空间条件下,环境重力明显不同于地面,不及地面重力十分之一的微重力是影响飞行生物生长发育的重要因素之一，研究表明，微重力可能干扰DNA损伤修复系统的正常运行，即阻碍或抑制DNA断链的修复。

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2空间辐射假说 卫星飞行空间存在着各种质子、电子、离子、粒子、高能重粒子(HZE)、X—射线、γ—射线及其他宇宙射线。这些射线和粒子能穿透宇宙飞行器外壁,作用于飞行器内的生物,产生很高的生物效应和有效的诱变作用。
3 转座子假说
随着基因组研究的深入和发展,中国科学院遗传研究所的专家发现了新的诱变机制,即转座子假说。该假说认为,太空环境将潜伏的转座子激活,活化的转座子通过移位、插入和丢失,导致基因变异和染色体畸变。这一新的发现为航天诱变育种机理研究增加了新的内容,加速了航天诱变育种机理的研究进程[8]。

四．复合诱变
某一菌株长期使用诱变剂之后,除产生诱变剂“疲劳效应”外,还会引起菌种生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢等,这对发酵工艺的控制不利,在实际生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法进行菌株诱变。
复合诱变包括:两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种或多种诱变剂的同时使用.普遍认为,复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单一诱变效果好. 如贺筱蓉等采用紫外同平板梯度浓度的亚硝基胍、纯铜蒸气混合诱变，筛选到高产菌株效价提高了53.2%，其原理可能是激光对经理化处理的微生物细胞有修复作用，使正突变率提高。但也有复合诱变使效果降低的例子。如吴振倡等在相同的条件下铜蒸气辐照龟裂链霉菌比其随后又用氯化锂复合处理效果好，可能是与氯化锂提高了细胞的修复系统的活性有关[9]。
复合因子较单一因子诱变效果有很大优势.但因目前大多微生物,尤其是抗生素产生菌的遗传背景不清楚,往往对诱变剂,特别是复合诱变剂的选择使用,带有很大的盲目性。

总之，诱变育种这种传统的育种方式虽然有弊端，但也具有菌种遗传稳定性高、简便、易行和安全等优点，我们相信微生物诱变育种技术将随着其它相关学科的发展而不断发展与完善！

参考文献：

[1] 房耀维,范琳,牛艳芳等 工业微生物育种技术研究进展 内蒙古师范大学学报　自然科学版 2003年６月第32卷　第２期 158~160
[2] 陈义光,李铭刚,徐丽华等 新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展长江大学学报{自然版}2005年5月第2卷 第五期 46~48
[3] 李万云,李韬 激光诱变育种技术的研究与开发应用前景 新疆农业科学 2006年 第43期 57~60　
[4]李豪,车振明 微波诱变微生物育种的研究 山西食品工业 2005年6月 第2期 5-7
[5] 虞龙,张宁 离子注入微生物诱变育种的研究与应用进展 微生物学杂志 2005年 3月 第25卷 第2期 80~83
[6] 王付转,梁秋霞,李宗伟等 诱变和筛选方法在微生物育种中的应用 洛阳师范学院学报2002年第2期95~97
[7] 董颖苹,连勇,何庆才等 植物化学诱变技术在育种中的运用及其进展Ⅰ.化学诱变技术及诱变效率 种子（Seed）2005年7月 第24卷第7期 54~58
[8] 王艳芳,王世恒,祝水金 航天诱变育种研究进展 西北农林科技大学学报（自然科学版）2006年1月 第24卷 第1期 9~12
[9] 陈立梅,汪 旭,李启云等 链霉菌诱变育种方法综述 吉林农业科学 2006，31（2）：62—封三