抗生素发酵过程优化技术研究

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[摘要]: 本文以抗生素发酵的工业生产为目标, 讨论发酵过程优化技术进展。认为当前存在的主要问题是缺乏以细胞代谢流为核心的过程分析, 采用动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法实质上只是化学工程动力学概念在发酵工程上的简单延伸。文章在研究反应器物料流与微生物细胞代谢流的相关特性后, 提出了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术, 先后成功地应用在青霉素、红霉素、金霉素、链霉素等发酵产品中。又进一步对抗生素作为次级代谢产物的参数相关特性进行研究, 认为由遗传因素决定的生物大分子合成体系的代谢特性与参数变化的松散相关或基因水平的启动相关, 造成以抗生素生产为目标的趋势曲线相关分析的困难。文章讨论了优化控制理论在抗生素发酵过程优化中的应用, 认为发酵过程初期出现的混沌现象, 应从细胞生物学角度找原因, 从宏观到微观, 由细胞生长代谢到基因表型特性, 有可能对提高抗生素发酵生产具有重要意义。
[关键词]: 抗生素; 发酵; 过程优化

采用发酵工程技术生产医药产品是制药工程的重要部分, 其中抗生素是我国医药生产的大宗产品, 随着基因工程技术的进展, 基因工程药的比例逐渐增大, 但抗生素在国计民生中所起的作用是不能完全替代的, 特别是西方国家出于能源和环保的考虑, 转产生产高附加值的药物, 留出了抗生素的市场空间, 为我国的抗生素生产发展提供了机遇, 作为一个发展中的国家, 可以说在相当长时间内, 我国抗生素生产在整个医药产品中仍占很大的比例, 因此抗生素类发酵过程优化技术研究对医药行业的生产具有重要的经济和社会意义。
1 抗生素发酵过程优化研究中主要存在的问题
长期以来为了提高抗生素发酵水平, 把注意力主要放在菌种筛选与改造, 或从国外引进菌株。近年来,随着现代生物技术的日益发展, 尤其是基因工程和代谢工程技术的发展, 已经取得了引入注目的效果, 主要有: ( 1) 将生物合成途径中关键酶基因克隆来改良现有抗生素生产菌种[1] ; ( 2) 将抗生素生物合成产生副产物的酶基因敲除, 以提高产生抗生素的能力[ 2] ; ( 3) 克隆外源基因以改良原菌种的发酵生理特性[3] ; ( 4) 克隆外源抗生素合成基因簇来合成新的抗生素等。但是在通过各种方法得到一个高产菌株后, 在实际发酵操作时,往往忽视了生物反应器中工程问题所必须加以考虑的工艺变化和过程优化。随后的逐级放大与优化基本上是以最佳工艺控制点为依据, 采用人工经验为主的静态操作, 在方法上基本以正交试验为基础。因此, 发酵过程优化与放大始终是生化工程中一个复杂问题的二个侧面, 人们从不同的角度进行研究[5] 。
此外, 随着计算机技术的迅速发展, 各抗生素发酵工厂已普遍采用计算机在线控制, 主要在补料操作上采用杯式流加技术, 基本上满足了抗生素工业发酵生产上所需要的高精度控制补料速率问题, 对提高发酵效价起了重要作用。但由于对抗生素发酵过程的认识不能深入, 对操作条件变化的适应能力差, 为此, 许多抗生素发酵工厂在生产罐上又进一步配置了溶氧电极、pH电极, 甚至排气氧和二氧化碳浓度测量。但对测量参数及其变化的意义缺乏理解, 由于以动力学研究为根据的反应器设计原理的局限性, 不能深入解释。例如发酵过程溶氧变化意味着什么? 是基因水平, 细胞水平, 还是反应器工程水平问题。大多仅停留在经验法则, 缺乏过程分析的理论指导, 因此, 计算机控制只能解决批间操作的不稳定问题, 对发酵获得的高效价批号不能总结, 一个新品种的投产仍需很长时期, 实际效果不明显。
因此, 在综合各种检测参数的基础上, 提出发酵过程的优化控制理论, 切实可行地解决工业生产中实际问题就成为当前工业发酵迫切需要解决的重要课题。

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2 基于参数相关的发酵过程优化技术研究
作者回顾了长期来发酵过程优化与放大所依据的基本思想和方法后, 认为采用以动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法, 实质上只是化学工程动力学概念在发酵工程上的简单延伸。例如, 用氨水调节pH 时, 关心的是最佳pH 值, 却不注意氨水加量的动态变化及其与其他参数的关系。在溶解氧浓度(DO) 测量与控制时, 关心的是最佳DO 值或临界值,不注意细胞代谢时的耗氧率, 更不去考虑从其他参数相关特性来解释细胞代谢或形态特性等变化。显而易见, 用在以活细胞代谢为主体的发酵过程就有很大的局限性, 应该重视细胞代谢流的存在。为此, 作者提出了以细胞代谢流为核心的生物反应工程学的观点[5] 。这些工程学观点包括生物反应器中多水平尺度问题( 分子水平遗传特性、细胞水平代谢调节、反应器水平的三传) 研究; 细胞代谢流分布变化的有关现象特征的获得与分析; 强调从宏观到微观的反应器物料流与微生物细胞代谢流的相关特性研究; 以及由于发酵过程的高度非线性和多容量特征, 提出数据驱动型的参数相关的优化与放大理论。通过实验研究, 又进一步提出了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术, 和发酵过程多参数调整的放大技术。
作者试图以生物反应器中物料流检测的观点, 在实验室规模发酵罐上除了常规的温度、搅拌转速、消泡、pH、溶解氧浓度( DO) 等测量控制以外, 还配置了发酵液真实体积、高精度补料量( 如基质、前体、油、酸碱物) 测量与控制, 高精度通气流量与罐压电信号测量与控制, 并与尾气CO2 和O2 分析仪连接, 整机具有14 个以上参数检测或控制。设计研制成能输入实验室手工测定参数的计算机控制与数据处理系统, 由此可进一步精确得到发酵过程优化与放大所必需的包括各种代谢流特征或工程特征的间接参数, 如耗氧率(OUR) 、二氧化碳释放率(CER) 、呼吸商(RQ) 、体积氧传递系数(KLa) 、比生长速率(L) 等。图1 为计算机参数检测与控制系统示意图,在装置研究的基础上, 形成了商品化实验室生物反应器, 定型为FUS250L ( A) 的新概念生物反应器[6] ,成功地应用在青霉素、红霉素、金霉素、链霉素等发酵, 取得了大幅度提高发酵水平的效果, 并直接放大到50 到100m3 以上生产规模发酵罐。

/ 八五0期间在华北制药厂以青霉素发酵为对象,在配有16 个检测参数的3m3 中试发酵罐取得优化成果后, 放大到120m3 规模取得成功。通过参数相关分析, 发现了发酵过程中物料平衡与不平衡问题是关键,并进一步提出了把重点放在不平稳问题的发现、分类、与解决的方法上[7] , 之后, 又提出了优化控制着重于工艺过程的细化与不平稳过程的研究, 放大研究着重过程的概括与平稳过程的处理, 进而发现了青霉素发酵过程中除溶氧外, 发酵液的混合和传递特性所引起的溶解二氧化碳的重要影响, 提出了克服措施, 达到提高发酵效价30%以上。最近, 为了解决某厂长期来青霉素发酵效价停止不前因而经济滑坡的局面, 在菌种不变的情况下, 利用FUS250L(A) 实验室发酵罐进行初步研究, 即达到提高发酵效价23% 在右。
/ 九五0期间, 以西安利君制药厂的红霉素发酵为对象, 在15L 实验室发酵罐取得成功后直接放大到50m3 生产规模时, 出现了严重偏差, 最后在提出的多参数调整的放大技术指导下, 通过工艺逐渐调整, 取得了提高4% 以上的效果。打破了我国红霉素发酵水平停止不前达二十多年之久的局面, 进入了国际先进水平。
我们又进一步开展饲料金霉素发酵过程优化与放大研究。在50L 实验室发酵罐进行实验研究, 发现糖代谢、氧浓度和磷酸盐浓度对金霉素合成的影响, 又研究从菌体生长控制着手, 控制菌体总量和菌体生长速率, 达到了预定目标, 然后直接放大到120 吨生产罐规模, 并采用了网络数据通讯技术, 实现1500 公里外的远程发酵过程诊断, 在发酵过程多参数调整的放大技术指导下达到提高发酵水平30%以上, 目前已进一步扩大到180m3 发酵罐生产规模, 初步开车投产, 产量超过原设计生产能力, 由1. 6 万吨提高到2. 1 万吨。
我们还开展了链霉素发酵过程优化研究, 发现了氨基糖苷类抗生素以氮源作为限制性基质发酵工艺的系统特征, 以及链霉素产生期由葡萄糖形成链霉胍、链霉糖和葡萄糖胺时的糖耗与二氧化碳释放率( CER) 的相关特性; 研究avermectin 发酵时, 发现了菌形特征变化与生物反应器剪切、供氧以及不同碳氮源之间的关系。

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3 次级代谢产物的发酵过程参数相关特性
上述研究成果揭示了抗生素作为次级代谢产物发酵过程的参数相关特性。图2 为一组由FUS250L(A)实验室发酵罐计算机人机界面上所得到的青霉素发酵多参数代谢趋势图, 从所得到的计算机数据采集趋势曲线( 包括直接参数、间接参数和离线实验室参数) 来看, 反映了发酵过程参数的多样性、时变性、偶合性和不确定性, 由此可得到发生在生物反应器中分子、细胞和工程三个不同水平的问题, 进而为装备和工艺技术改进提供了依据。但是从现有国内研究水平来看, 大多只停留在工程水平上, 也就是从通气、搅拌或发酵罐型式上进行改进, 提高供氧能力。在工艺上, 通过调整培养基, 寻找温度、pH、DO 或中间补料策略控制等最佳工艺操作参数, 大多以单参数的经验摸索为依据。近年来细胞代谢工程的研究, 有关代谢流的分布, 基因水平和细胞水平的代谢调控研究有大量报道, 这些研究工作为菌种改造以及发酵过程的代谢调控将起到重要作用, 但是一到发酵罐实际操作时, 由于发酵过程酶学研究的困难, 以及过程数据采集和处理的困难, 发酵工艺优化研究的基本思路仍旧是寻求培养基配方和最佳的温度、pH、DO 等。缺乏能反映细胞代谢物质流所引起的生物反应器物料流变化的相关特性的分析。

从大量的实验研究来看, 就生物反应器操作来说,反映基因水平的参数相关是今后提高抗生素发酵水平的关键。胞内基因水平的信息流决定了细胞代谢流分布的空间与时间的基本特征, 而反应器只是在环境条件和过程传递特性上, 从物料和能量供应上对这一代谢流产生影响。就细胞内代谢来看, 图3 表示了微生物主要代谢体系[8] , 大致可分为多条途径利用的碳源分解代谢体系( 可简称体系Ñ ) , 以反馈调节为主要的结构单元的合成体系( 简称体系Ò ) , 和由遗传因素决定的大分子的合成体系( 体系Ó ) 。外界环境条件的控制, 首先是对体系Ñ 发生影响, 体系Ñ 与体系Ò 的联系往往是紧密的, 但与体系Ó 是松散的, 而抗生素是由体系Ó 形成的。图4 表示了不同代谢体系与参数相关特性, 参数曲线的相关可明显地反映Ñ 和Ò 体系的代谢特性, 而与体系Ó 的代谢特性关联往往不明显, 但有时表现为基因水平的启动表达关系, 即外界诱导因子的开关关系, 因此, 造成以抗生素生产为目标的趋势曲线相关分析的困难, 必须从大量实践中找出有效的相关特性, 并结合基因水平的分析研究, 一旦有所突破就有可能取得过程优化的重大进展。此外, 从细胞经济原理来看, 要使代谢产物累积增加, 各体系运转的独立性就要增加, 仅以主要反映体系Ñ 的代谢变化的参数相关就更难反映体系Ó 的变化, 所以也必须进行大量的实验研究。

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4 过程优化控制理论的应用及其发展
抗生素发酵过程优化的另一重要内容就是各种控制理论的应用。早在上世纪中叶, 人们为了研究微生物过程特性, 开展以微生物细胞生长、代谢及有关产物形成等动力学研究, 先后建立了Monod、Contois 等数学模型, 随着以生产为目的的发酵过程优化技术的研究深入, 特别是对细胞大规模培养技术的深入研究和对以分批培养为主要对象的发酵过程参数的时变性、多样性、耦合性和不确定性的认识, 在过程动力学数学模型为基础上, 引进了一系列现代控制理论[11~ 13] , 其中有静态和动态优化、系统识别、自适应控制、专家系统、模糊控制、神经元网络等。这种适应发酵过程非线性特征的研究方法为细胞大规模培养技术研究的深入开展以及提高学术研究水平起了很大的推进作用, 但在实际工厂生产上仍有很大局限性。造成这种局限性的原因除发酵过程的高度非线性的多容量特性, 很难用一组线性或拟线性数学模型来精确描述外, 如何实现从宏观描述到微观研究也是一个重要原因。本文提出的在发酵过程研究中应该重视细胞代谢流的问题实质图3 微生物基本代谢体系图4 不同代谢体系与参数相关上就上就属这种性质的问题。
从控制论来看, 当前一个热点课题之一就是混沌现象的研究[14] 。在我们进行抗生素发酵研究时, 常发现发酵初期表现出过程的多态性和不稳定性, 输入的初始条件的极细微的差别会产生结果的巨大变化, 这就是所谓发酵过程的混沌现象。混沌是非线性系统所特有的一种运动形态, 它是确定性系统里由于内部随机性而产生的貌似无序的复杂运动。但上述关于混沌现象的研究只是停留在对微生物过程混沌现象的揭示与表征, 对导致生物系统出现混沌现象的微观机理未抗生素发酵过程优化技术研究 张嗣良等# 575 #做任何涉及。任何生物现象问题必需要从细胞生物学角度找原因, 这是近年来生物技术发展的共识, 因此我们认为, 如何从微观认识来解释上述现象对抗生素发酵过程优化与放大研究将具重要意义。这也是当前化学工程与生物技术深度结合形成生物化工的新特点:由宏观迈向微观, 强调在生物技术深入发展的基础上,以微尺度的工程学观点研究过程特性。例如有人研究认为在发酵初期菌体处于对数生长阶段时, 在数学模型研究时随着引入阶数的增加, 菌体浓度随着滞后时间的增大已经有了明显的振荡, 不再表现为单纯指数型生长, 若此时发酵过程出现底物限制或产物抑制, 以及代谢途经或调控操作等的改变, 发酵过程将会发生周期、倍周期分岔直至混沌, 就显示出过程的多态性和不稳定性。
我们在红霉素与金霉素等抗生素发酵研究时, 发现早期CER、pH、DO、OUR、RQ 有一个相对应的上升峰或下降峰, 反映了发酵初期的系统特征, 并进一步通过在线计算机数据采集的RQ 值变化, 发现在一定时期有机氮源同时被作为碳源使用, 即以碳氮骨架通过氨基酸进入到菌体, 如这时控制不恰当, 就会发生抗生素生产能力的大起大落, 即所谓混沌现象。经初步研究和有关文献报道, 发现可能是原核细胞中的一种普遍的代谢调控机制: 严谨响应( stringent response) [16, 17] 。即当生长环境中的氨基酸成为限制条件时, 空载tRNA水平升高, 当空载tRNA 进入核糖体后, 启动严谨响应因子, 同时伴随着菌丝分化现象及次级代谢产物合成的启动。这种状态反映了基因表型和细胞代谢特征的变化, 控制混沌可以得到我们所需要的细胞生理状态,有可能对提高抗生素发酵效价具有重要意义。

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