RNAi实验原理与方法选择

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一、RNAi的分子机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

二、如何进行RNAi试验
(一)siRNA的设计

1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

2.RNAi目标序列的选取原则：
(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

3.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

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(二)siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

1． 化学合成生产siRNA
优点：方便，研究人员几乎不需要做什么工作。
缺点：价格较贵，效率只有转录合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持续时间短，对细胞毒性大，转染效率低，此外由于合成工艺上存在不可弥补的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能纠正合成中产生的20%左右的碱基错误。
适用于：建议不再采用此种合成方法。
不适用于：基本上对目前所有的实验室来说均不适用。
评价：☆☆☆☆☆

2． 生物合成转录生产编码siRNA
优点：价格较低，抑制效率高，低浓度的siRNA即可达到抑制效果。体外转录合成，比较接近生理状态。
缺点：无法保证有效性，实验规模受到限制，不能进行大量的生产，不能维持长时间抑制效应，而且需要用户参与操作，难以保证实验的一次成功性。
适用于：筛选siRNAs特别是需要制备多种siRNAs，考虑合成价格时。
不适用于：实验需要大量的一个特定的siRNA。长期研究。
评价：★★★☆☆

尽管有些公司推出了shRNA和siRNA试剂盒，但这些试剂盒大都突出操作简单，毕竟涉及RNA操作，用户自己难免会产生很多预料不到的困难，晶赛公司可以完全为您解决后顾之忧，您可以直接拿到有效的siRNA或shRNA序列。

3． Dicer酶法生产siRNA
优点：可以跳过筛选与检测有效siRNA序列的步骤，节省时间和开支。
缺点：有可能引发非特异性的基因沉默，尤其是同源或者密切相关的基因。
适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长期研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究
评价：★★★☆☆

4．编码shRNA的载体生产siRNA
优点：制备质量可控性好，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，可以大量扩增。
缺点：转录后的shRNA的正确折叠率不能保证，有可能因此造成非特异性抑制，质粒载体转染效率不稳定，与细胞类型有关。
适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作
评价：★★★★☆

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5．病毒粒子生产shRNA
优点：易于制备、纯化、浓缩,宿主范围广,感染率高,理化性质稳定,不整合宿主基因组,遗传毒性和免疫毒性低，是目前最好的RNA干扰技术之一。
缺点：耗费时间比较长，即使是用最快的也得60天左右，对实验条件要求较高，容量偏小，有可能伴随部分炎症反应。
适用于：转染效率低无法解决，需要维持较短时间的基因沉默的siRNA
不适用于：大量筛选siRNA或长时间的研究，主要原因是价格因素
评价：★★★★★

晶赛公司拥有一项未公布的病毒制备技术，可以在15天内完成shRNA病毒制备，价格接近shRNA制备的其他方法，将极有可能取代常规病毒表达shRNA的方法成为最佳的RNA干扰技术。

6．PCR制备shRNA表达框生产siRNA
优点：成本较低，方便快捷，可以用于有效序列的筛选，可以用于质粒载体构建。
缺点：转染效率低，不适合大规模制备。
适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
评价：★★★☆☆

晶赛公司推荐给您的RNAi实验方法的参考模式：
1． 确立需要干扰的目标基因
2． 检查使用细胞的转染情况
可以选择一个4kb左右大小的质粒和可实施的转染方法，检测转染效率
转染效率超过40%：可以选择任何一种RNA干扰方法。
转染效率介于10%-40%：可以选用体外合成的si RNA或者带有筛选标记的shRNA质粒表达载体。
转染效率低于10%：带有筛选标记的shRNA质粒表达载体或病毒载体。
3． si RNA序列选择设计
制备20-30个si RNA序列，选择有效序列或委托专业化公司（如：晶赛生物）设计（3个序列保证1个有效）
4． 开始实验

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三、RNAi的应用前景
1. 研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。

2. 研究信号传导通路的新途径
联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转

染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点， 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。

3.开展基因治疗的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。

肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。

尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段，但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中重要的组成部分，人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。