求教大肠杆菌高密度发酵的问题

hanjun80

我们在做大肠杆菌的工程菌株发酵。以下是基本信息：
菌株为B21(DE3)；
携带质粒为PTRC99Z质粒（有外源基因）；
发酵罐：5L
培养基：多种培养基都试过。包括无机盐、复合培养基（配方见《高细胞密度发酵技术》 李寅 等 著，化学工业出版社）。碳源用过葡萄糖以及甘油，现象相似。
发酵液pH:6.8，以氨水调控；
发酵罐温度：25~30都用过，用以调节发酵初期细菌比生长速率；
发酵罐罐压：0.06、0.04MPa以及0.02MPa都试过；
转速：从400~900rpm都试过；
通气量：200L/h到400L/h都试过；
通过补料速率，控制溶氧为30%；

现象：
不管培养基、发酵工艺是什么样，每次菌长到0D600=30，就开始增长速度极慢（期间没有加任何诱导剂哦）；尽管发酵液离心后沉淀量一直增加，但是OD600的吸光值变化不大，甚至有所降低；
发酵液粘度增加，泡沫较大；
碳源一直在消耗，但是生物量不增加，产酸量大（因为消耗氨水量大）；
离心后，菌泥呈两种颜色，下层为乳白色（颜色稍稍淡黄，健康大肠杆菌颜色），上层颜色较深。

遂请问各位达人，上述现象原因为何？如何解决这些问题？不通入高浓度氧时候，OD最高能到多少（请生产PHB和PHA的朋友忽略这个问题）？

gx0406

用的什么有机和无机氮源？另外，有一个关键的问题你可能忽略了，发酵液中残糖维持在多少？乙酸浓度过高会抑制菌体生长。

hanjun80

gx0406 发表于 2012-12-9 23:22
用的什么有机和无机氮源？另外，有一个关键的问题你可能忽略了，发酵液中残糖维持在多少？乙酸浓度过高会抑 ...

用的有机氮源:
1.酵母抽提物
2.蛋白胨
3.蛋白胨+酵母抽提物;

至于碳源浓度,都是培养基的初始碳源消耗完以后才开始流加，甘油做碳源的时候我没有测过培养基的碳源浓度，但是葡萄糖做碳源时候，斐林试剂滴定法测碳源浓度发现葡萄糖浓度较低，我的溶氧是由碳源流加速度控制的，溶氧浓度在30~60％。

乙酸的确抑制大肠杆菌生长，但是乙酸合成原因是什么?我一直怀疑是种子或溶氧的问题，造成乙酸的合成，进而抑制大肠杆菌生长，因为1）我们的甘油种子是保存在-20℃;2）很多文献包括论坛上都说要通入高浓度氧，而我从来没有用过。

楼上大侠觉得是哪方面的问题?

hanjun80

gx0406 发表于 2012-12-9 23:22
用的什么有机和无机氮源？另外，有一个关键的问题你可能忽略了，发酵液中残糖维持在多少？乙酸浓度过高会抑 ...

用的有机氮源:
1.酵母抽提物
2.蛋白胨
3.蛋白胨+酵母抽提物;

无机氮源：
1、磷酸二氢铵；
2、硫酸铵。

至于碳源浓度,都是培养基的初始碳源消耗完以后才开始流加，甘油做碳源的时候我没有测过培养基的碳源浓度，但是葡萄糖做碳源时候，斐林试剂滴定法测碳源浓度发现葡萄糖浓度较低，我的溶氧是由碳源流加速度控制的，溶氧浓度在30~60％。

乙酸的确抑制大肠杆菌生长，但是乙酸合成原因是什么?我一直怀疑是种子或溶氧的问题，造成乙酸的合成，进而抑制大肠杆菌生长，因为1）我们的甘油种子是保存在-20℃;2）很多文献包括论坛上都说要通入高浓度氧，而我从来没有用过。

楼上大侠觉得是哪方面的问题?

hanjun80

用的有机氮源: 
1.酵母抽提物 
2.蛋白胨 
3.蛋白胨+酵母抽提物; 
 
无机氮源： 
1、磷酸二氢铵； 
2、硫酸铵。 
 
至于碳源浓度,都是培养基的初始碳源消耗完以后才开始流加，甘油做碳源的时候我没有测过培养基的碳源浓度，但是葡萄糖做碳源时候，斐林试剂滴定法测碳源浓度发现葡萄糖浓度较低，我的溶氧是由碳源流加速度控制的，溶氧浓度在30~60％。 
 
乙酸的确抑制大肠杆菌生长，但是乙酸合成原因是什么?我一直怀疑是种子或溶氧的问题，造成乙酸的合成，进而抑制大肠杆菌生长，因为1）我们的甘油种子是保存在-20℃;2）很多文献包括论坛上都说要通入高浓度氧，而我从来没有用过。 
 
楼上大侠觉得是哪方面的问题?

gx0406

乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。在低速生长条件下
通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙
酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅依靠氧化代谢不能提供足够的能量，必
须通过乙酸生成途径储备 ATP 和 NADH2。
----可见限制比生长速率能减少乙酸的生成，因此尝试增加碳氮比，即降低氮源含量；另外，限制葡萄糖比消耗速率，残糖维持在0-0.1%。菌体不长的情况我们也遇到过，但只是停止生长几个小时，随后就正常了，很可能也是乙酸抑制的原因。

hanjun80

我们是通过控制发酵温度和糖流加速率调控比生长速率的，一般在0.2左右。至于氨氮，我们维持200~700mg/L。
一般来说，氨水用于调控发酵液pH，以下两个情况会造成氨水流加：1）培养基中的氮源消耗，产生酸根。理论上，这不会造成培养基pH的增加；2）发酵产酸，这会造成培养基氨氮浓度增加。
因此，请问楼上，根据你的经验，这么低比生长速率，残糖和氨氮浓度不高，为何产酸量大?