适用于基因工程药物生产的系列大肠杆菌细胞非融合可溶性高效表达质粒

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加入时间：2008-6-10 9:26:38　　延边州经济委员会　　点击：9
   
项目适用性:

1.本系列表达质粒适用于单纯肽链基因工程药物生产。

2.本系列表达质粒适用于国家新生物制品注册分类中1、2、6、7、9、10、11、12、13、14的原料药生产。

项目特点:

随着二十世纪70年代大肠杆菌基因表达分子机制的深入了解，外源目的基因在大肠杆菌中的高效表达成为可能，同时，大肠杆菌表达系统技术也是最早应用于基因工程药物生产。由于大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖快，成本低，表达量高，易于操作等诸多优势，目前大多数基因工程药物生产都是由大肠杆菌表达系统技术来实现。基于克服大肠杆菌缺少翻译后修饰、高表达时易折叠错误而形成包涵体等不足，人们已开发出了多种其它类型的表达体系，如酵母、昆虫、植物、哺乳动物等表达体系，但目前尚不能完全取代大肠杆菌表达体系。

许多外源蛋白在大肠杆菌中的高水平表达最后都会导致包涵体形成, 包涵体是致密的不溶性蛋白和RNA的聚集体，含有大部分的表达蛋白。关于包涵体的形成有许多理论，众说纷纭，但一般认为，许多蛋白质的天然构象，并不是自发地一步折叠形成的，而是在一些辅助蛋白协助下，经过许多中间态逐步形成的。按照蛋白质折叠的理论，体内蛋白聚集以致包涵体的形成，起源于肽链折叠过程中，部分折叠的中间态之间的特异性的错误聚合，而不是形成于成熟的天然态或完全解链的蛋白。蛋白质沉淀形成包涵体有利的一面是可以利用包涵体的不溶性和致密性，通过超声波破碎、离心就能相对容易的对其进行初级纯化。纯化时可用盐酸胍或脲变性剂溶解包涵体中的蛋白质。透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠复性，然而这种方法的最大弊端，是经变性/复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，尤其是表达产物富含二硫键时更显突出。

防止包涵体形成，最现实的办法是改善发酵条件，从培养和诱导条件入手。如降低大肠杆菌的生长温度，以减少肽链间疏水表面相互作用，增加折叠成可溶性空间结构的机会，改变pH值、缩短诱导时间、降低诱导物浓度等，但这类方法多是以牺牲表达量为代价。

鉴于大肠杆菌胞内折叠组装能力非常有限，可采用分泌途径表达重组蛋白，包括转运(蛋白质通过细菌的内膜定位于周质空间)、分泌(穿过外膜到达胞外)。外源蛋白在细菌周质中的成功分泌需要在N端融合一段细菌蛋白的疏水性信号肽，融合蛋白跨内膜后，细菌的信号肽酶将信号肽切除，因而可获得具有天然一级结构的产物。胞外分泌避免许多问题如包涵体的形成，同时可使纯化较为简单。但这一系统的缺点是表达量低，此外信号序列去除较困难或去除不彻底。

通过替换个别氨基酸，来寻找可生成天然蛋白的突变体，这种方法对一些蛋白的表达是行之有效的。但在实践中则存在两个问题：一是难以预测哪种氨基酸的替代利于天然蛋白的生成；更重要的是由此产生的突变基因产物，溶解性虽有提高，但是对于蛋白质的功能、稳定性和药物学特性可能会有不良影响。

融合蛋白表达，是防止包涵体形成的另一胞内表达重要方式。虽然融合蛋白表达解决了外源基因表达的很多问题，但是，融合表达也有其缺点，如果融合蛋白的两部分互相作用很容易受蛋白酶的水解，融合蛋白部分与基因表达产物间的断裂及效率和成本，分离纯化去除融合蛋白时的成本等，也使得融合表达有其局限性。

非融合表达是指所表达的外源蛋白不含其它生物的多肽链，只要求表达起始位点ATG必须位于所要表达的外源基因5'端,其3'端加终止密码子,在合适的原核启动子和SD序列下游构成表达系统时,就可以在原核生物中表达出外源蛋白(表达的外源蛋白N端多一个Met)。鉴于外源基因在大肠杆菌细胞非融合表达的现状，尤其是表达产物富含二硫键，利用大肠杆菌细胞进行基因工程药物生产时，包涵体的变性/复性生物活性收率低，或为解决可溶性表达等所引起生产成本提高等，甚至利用大肠杆菌无法进行基因工程药物生产，基于上述现实问题，课题组构建了系列大肠杆菌非融合表达质粒，利用某些因子的生理生化特性，促进外源基因在大肠杆菌细胞以非融合的形式进行可溶性高效表达。该系列大肠杆菌非融合表达质粒具有自主知识产权。

构建的系列大肠杆菌非融合表达质粒pSYPU，具有卡那霉素抗性, 外源基因的表达是由T7-lac双启动子及原核细胞SD序列调控，大肠杆菌培养和诱导表达均在37℃一个温度下进行，IPTG或相关物质诱导外源基因表达（有时可不需诱导直接表达），可使外源基因非融合可溶性高效表达，尤其可使富含二硫键的表达产物得以非融合可溶性高效表达，可溶性表达产物占该总表达产物的95％以上。

本系列非融合表达质粒最低确保客户所要在大肠杆菌表达的基因工程药物占菌体总蛋白的12％，可溶性表达产物占总表达产物的95％。

目前进度:

大肠杆菌非融合表达质粒pSYPU－1a可使真核生物蛋白Ⅰ得以可溶性表达，真核生物蛋白Ⅰ由八十余个氨基酸残基组成，分子量9.2kDa, 含八个半胱氨酸残基，形成四对二硫键。重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌，37℃培养后IPTG诱导培养3小时，收集菌体并超声裂菌，离心获得上清和沉淀两部分产物。SDS-PAGE成像系统分析表明：表达产物占菌体总蛋白的20%左右，表达产物存在于超声裂菌上清液部分，占该表达产物总表达量的95％以上。利用大肠杆菌表达质粒pET28同上条件非融合表达真核生物蛋白Ⅰ，SDS-PAGE成像系统分析表明：该系统的表达产物90％以上为不溶的包涵体形式。

大肠杆菌非融合表达质粒pSYPU－3b可使人源的基因工程药物得以可溶性表达，该基因工程药物由近二百个氨基酸残基组成，分子量20kDa左右, 含四个半胱氨酸残基，形成两对二硫键。同上条件表达，SDS-PAGE成像系统分析表明：表达产物占菌体总蛋白的16%左右，表达产物存在于超声裂菌上清液部分，占该表达产物总表达量的95％以上。利用大肠杆菌表达质粒pET23同上条件非融合表达，该系统的表达产物97％以上为不溶的包涵体形式。

大肠杆菌非融合表达质粒pSYPU－2c可使真核生物蛋白Ⅱ得以可溶性表达，真核生物蛋白Ⅱ由六十余个氨基酸残基组成，分子量7.8kDa, 含八个半胱氨酸残基，形成四对二硫键。同上条件表达，SDS-PAGE成像系统分析表明：表达产物占菌体总蛋白的19%左右，表达产物存在于超声裂菌上清液部分，占该表达产物总表达量的95％以上。利用大肠杆菌表达质粒pET19同上条件非融合表达，该系统的表达产物92％以上为不溶的包涵体形式。