评价饲料酶质量的5种指标

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评价饲料酶质量的5种指标

    目前，关于饲料酶的生产和应用的报道很多，从报道的内容分析，无论是生产水平还是质量鉴别能力都比以前有很大提高，但是目前还有很多问题需要研究。
    目前广泛使用的植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果胶酶都有很多同功酶。只要产酶的微生物不同（工程菌除外），酶蛋白的结构通常也是不同的。根据最近的研究发现，植酸酶（可能是结构最简单的饲料酶）至少有30种的同功酶，它们的活力表现随pH值的变化情况都是不同的。至于其它饲料酶，例如木聚糖酶，至少有200种同功酶。
    很多饲料酶使用者希望能有一套类似NRC的饲料酶使用标准或模板，供行业参考。事实上这几乎是不可能的，至少在最近的数十年内这种设想还不成熟。饲料酶的质量评判和选用涉及很多因素，远比普通的工业用酶复杂。一般的工业用酶，如淀粉酶和糖化酶，它们的使用场合比较固定，有比较确定的pH值、温度、底物和作用时间，而且酶活成分也比较单一明确。但是对于饲料酶，由于饲料原料、加工要求和动物消化道pH的多样性，需要考虑的因素很多、很复杂。
     动物饲养试验经常发现，同样活力的饲料酶，使用效果会不一样，而且有时差异还很大。如：①同样是5 000U/g的植酸酶，而且酶活定义和测定方法都符合GB/T18634—2002，为什么在蛋鸡料中A酶需要添加100g/t才能达到与B酶添加60g/t同样的效果？②为什么有的酶在蛋鸡料中有效果而在生长猪料中效果很小，而有些酶无论在猪料还是在鸡料中都有较好的效果？③为什么有些酶在仔猪料中有效果而在生长猪料中没有效果？要回答这些问题，需要对饲料酶产品中酶活成分以及影响酶活力的因素进行详细的分析。分析的因素主要有：酶活力定义、pH值、温度、反应时间、底物性质及其浓度、耐酸稳定性等。关于酶活测定温度、反应时间比较容易理解。饲料酶的活力测定温度一般都选择在37～ 40℃，反应时间选择在15～30min。关于酶活力的定义，目前已经逐步改变了前几年的混乱局面，多数使用国际单位，即每分钟内从底物溶液中降解释放1μmol还原产物所需要的酶量。需要重点考察的是pH值、耐酸稳定性和作用底物。
1  pH值对酶活力的影响
    由于动物消化道食糜的pH值变化范围很大，所以单纯考虑在某个pH值条件下的酶活表现值是不全面的，最好能测定该酶活组分在比较广泛的pH值范围内的活力表现。如图1所示，两种植酸酶A和B酶活比较。

    植酸酶A在pH5.5时有一个高峰值，而在其它pH条件下表现活力都很低。当pH值低于3.5以后基本没有活力。但是植酸酶B不仅在pH5.5有一个峰值，在pH2.5时也有一个峰值，其作用范围要比植酸酶A宽得多，使用效果也要优于A。显然，要想达到同样的使用效果，植酸酶A的添加量必须高于B。
2 酶反应底物的分析
    底物的类型对酶活的测定值有很大影响，比较典型的是纤维素酶活力的测定，见表1。

    纤维素酶是一种复合酶，天然的纤维素都是不溶解于水的高分子聚合物，降解这种聚合物需要多种酶活力的协同组合。根据目前的研究发现，有实际使用价值的纤维素酶至少含有4种活性（C1酶、Cx酶、纤维二糖酶和 β-葡萄糖苷酶）。滤纸酶活（FPA）体现了各活性组分的复合效应，比较符合纤维素酶的实际使用效果。CMCase（以羧甲基纤维素为底物的纤维素酶测定值）没有体现C1酶的效应（把天然的结晶纤维素分解为可溶于水的游离纤维素），而在实际使用过程中C1酶通常是限速反应的关键酶。显然，以FPA作为选择饲料纤维素酶的依据比CMCase更合理（即选择纤维素酶B比较好）。但是，准确测定FPA比较困难，而且数值也比较低，目前绝大多数纤维素酶产品的活力都是以CMCase来表示（包括国外）。
    木聚糖酶是第二大饲料用酶，对它的研究也很多。相对而言，木聚糖酶的结构要比植酸酶复杂，影响的因素也更多。木聚糖酶主要有二大类：造纸用木聚糖酶和饲料用木聚糖酶。造纸用的木聚糖酶的测定底物是桦木木聚糖（birchwood xylan），而饲料用木聚糖酶的测定底物是燕麦木聚糖（oat xylan）。因此根据表2的分析结果，选择木聚糖酶A作为饲料用酶比较合理。
   那么如果都采用燕麦木聚糖（Sigma X0627）作为底物，其它测定条件也一样。比较如下2种木聚糖酶C和D（见图2），在pH值2.0～7.0的范围内，木聚糖酶C的表现值始终高于木聚糖酶D，是否就可以确定木聚糖酶C优于D呢？
  用无淀粉麦麸作为实际作用底物进行试验，发现结果与图2显示的结果相反，木聚糖酶D优于C（见图3）。
     在200ml醋酸-醋酸钠缓冲液（pH5.5）中加入10.0g无淀粉麦麸和0.50g木聚糖酶，在40℃保温8.0h。木聚糖酶D可以降解20.5%的麦麸，而木聚糖酶C只能降解18.7%的麦麸，其原因与纤维素酶的情况类同。试验使用的木聚糖酶是一个复合酶，燕麦木聚糖（Sigma X0627）是溶于水的，而在饲料中存在的木聚糖绝大多数是不溶于水的。
3 酶蛋白的耐酸稳定性
     饲料酶的耐酸稳定性也是考察饲料酶质量的一个指标，如图4、图5、图6和图7所示，比较米曲霉和黑曲霉发酵物中的酶活力。
    除了果胶酶以外，黑曲霉发酵产物中的各酶活几乎都要比米曲霉发酵产物中的活性高。使用在仔猪料中，黑曲霉发酵物的效果要优于米曲霉发酵物；但是，添加在生长猪料中发现米曲霉发酵物要优于黑曲霉发酵物。通过耐酸性试验发现，米曲霉发酵物中酶蛋白的耐酸性要明显优于黑曲霉发酵物。在pH值2.5的条件下40℃保温2h，米曲霉发酵物中的木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的酶活损失都不超过20%，而黑曲霉发酵物中的酶活损失几乎都超过了70%（见表3）。
    但是在pH值大于4.0的条件下，这2组酶系均有很好的稳定性。在pH4.0的条件下40℃保温2 h，酶活力损失均不超过20%（见表4）。
    生长猪胃酸较多，pH值很低，对黑曲霉发酵物的活性成分破坏较大。而仔猪胃酸较少，pH值在4.0左右，对黑曲霉发酵物的活性破坏较少。
4 关于液态发酵和固态发酵产品的分析
    目前，国内几乎所有液态发酵生产饲料酶的企业都宣传液态发酵的产品优于固态发酵的产品，很多从事动物营养学研究的科研工作者也赞同这个观点。事实上这个论点有很大的片面性，固态发酵生产在中国、印度、巴西等发展中国家存在，在日本、荷兰等一些发达国家也很受重视（主要是能耗低和基本没有污染排放），固态发酵产品的质量也很好。如果产酶菌是霉菌（事实上天然的酶制剂高产菌大多数是霉菌），相对液态发酵而言，固态发酵的产品有以下2个方面的优势：①酶蛋白属于次级代谢产物。霉菌的次级代谢产物通常是在霉菌进行分化时形成的。液态培养抑制霉菌分化，所以霉菌固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高5～10倍；②固态发酵的原料比较粗放，终产物往往含有多种酶活性，很适合于用作饲料添加剂。而液态发酵的酶系往往比较单一，往往只有一种酶活比较高，而其它组分的酶活很小。
     饲料原料中含有很多非淀粉多糖，分解这些非淀粉多糖需要一组或多组酶系的共同协作才能完成。固态发酵生产的非淀粉多糖酶通常都含有多个亚基甚至多个酶系，固态发酵的底物基本上都是农副产品（主要是麦麸），底物的诱导效应使得发酵产生的酶系有很好的针对性。在酶活测定值相等的条件下，固态发酵生产的酶在饲料中显示的效果往往要比液态发酵生产的酶更为显著。
     固态发酵最大的缺点是机械化程度低，劳动强度大，很难进行细菌和酵母的培养。目前高产酶的基因工程菌基本上都是酵母菌和细菌，只能采用液态发酵。
固态发酵主要有托盘式、厚层通风式和转鼓式3种。托盘式产量最小，但是具有投资少、操作简便和产品质量好等优点，国内很多企业采用这种方式，利润空间也比较大。托盘式发酵生产一吨成品原曲需要耗费32～36个劳动日，这在西方发达国家是难以承受的，但是在发展中国家目前还是可以操作的。
5 耐热和储存稳定性
    耐热稳定性需要考察二种情况，一种是干物质的耐热性能，另一种是在水溶液中（或高水分条件下）的稳定性。有报道说某种饲料酶耐热性能很好，可以耐受饲料的高温制粒而不失活，这种说法是不全面的，有些酶在干物质条件下有很好的稳定性，但是在高温水溶液中（或含水量很高的物料中）会很快失活。笔者曾测试一种木聚糖酶，在干粉（含水量不超过10.0%）条件下，105℃保温2h，酶活损失不超过10.0%，但是在80℃水溶液中保温5min，酶活损失超过40.0%。进一步试验发现这种木聚糖酶在饲料的高温制粒（85～90℃）过程中活力损失通常要超过24.0%。当然，如果不考虑高温制粒，笔者建议优先选择价格比较低廉而且活力比较高的粉状饲料酶。
    储存稳定性对于某些酶产品是必须考虑的。有些霉菌产纤维素酶的能力很强，但是产品的储存稳定性很差。即使在冬季（环境温度不超过15℃）存放3个月，活力损失也要超过50.0%。显然，这种情况无论是对于生产企业还是用户都要引起重视。
饲料酶质量的评价涉及很多因素，很多科研工作者在这个领域进行了大量工作，积累了很多经验。但是由于问题的复杂性，目前还没有成型的公式可以参考。以前笔者曾设想通过实验室的酶活分析来推算其使用效果，并发表了一些这方面的言论，现在看来，有些观点是片面的、甚至是错误的。关于饲料酶的研究，我们仅仅处于起步阶段，不知道的远远多于知道的。