纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定

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纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
1.        纤维素CMC酶
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用。
3.0原理
   纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0试剂
4.1无水醋酸钠(分析纯)
4.2冰醋酸(分析纯)
4.3 3.5－二硝基水杨酸
4.4无水葡萄糖
4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
4.6氢氧化钠(分析纯)
4.7重蒸苯酚(分析纯)
4.8无水亚硫酸钠(分析纯)
4.9叠氮化钠(分析纯)
4.10羧甲基纤维素钠
5.0仪器
5.1水浴锅(恒温)50±1℃
5.2电热干燥箱80±1℃
5.3 722型分光光度机计
5.4分析天平感量0.1㎎
5.5一级玻璃制品
5.6电冰箱
6．0试剂的准备
6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:
溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
    将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7．0标准曲线制作：
7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。
7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
7.3标准葡萄糖曲线制作
    取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。

8.0 CMC酶活性测定。
8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1ug还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。

8.2分析程序：
    取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm下测OD值。
9.0计算活力单位
            A×D×5×1000
CMC酶活力=————————u/g(ml)
                30
A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）
D：酶粉（液）稀释倍数

2.        FPA酶
即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素，释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成正比关系。通过在550NM的光吸收值查对标准曲线，可以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。

3.        半纤维素酶：
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用
3.0原理
半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
4.0单位定义
一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
5.0试剂
5.1无水醋酸钠（分析纯）
5.2冰醋酸（分析纯）
5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）
5.4木糖（分析纯）
5.5四水酒石酸钾钠（分析纯）
5.6氢氧化钠（分析纯）
5.7重蒸苯酚（分析纯）
5.8无水亚硫酸钠（分析纯）
5.9叠氮化钠（分析纯）
5.10木聚糖（分析纯）
6.0仪器
6.1水浴锅（恒温）50±1℃
6.2电热干燥箱80±1℃
6.3 772型分光光度计
6.4分析天平感量0.1
6.5一级玻璃制品
6.6电冰箱
7.0试剂的制备：
7.1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml配成0.1MNaNC溶液。
溶液B：称取8.2gNaAC，溶解后容至1000ml，制成0.1MNaAC溶液。
使用溶液以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
7.2 DNS试剂
溶液A：称分析纯NaoH104g，溶于1300ml水中，加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。B：称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
7.3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。
8.0标准曲线制作：
8.1木糖80℃烘干至恒重。
8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
8.3标准木糖曲线制作
取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml，加入2.0mlDNS试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。
9.0半纤维素酶活性测定；
    15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml（三支平行样），再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液，摇匀，50℃水溶60分钟，取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10分钟，冷却后，补加水定容到15ml，轻轻上下摇匀，空白用0.2ml稀释酶液加。1.8ml醋酸缓冲液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。
10.0计算活力单位:
半纤维素酶活力=(A×D×5×1000)÷60 u/g(ml)
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)
D:酶粉(液)稀释倍数