甘油分析仪在发酵表达中应用研究

金玉良缘

甘油分析仪在发酵表达中应用研究
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一、    检测原理
利用生物酶只能催化一种或一类底物的性质，将甘油氧化酶进行固定化处理，样本中的甘油在甘油酶膜的作用下被催化生成过氧化氢，根据电化学的原理，过氧化氢的浓度与电压值正相关，根据标准液、缓冲液的电压值响应值来确定样本中甘油浓度



甘油浓度与电压值相关性分析
二、    应用案例
（1）甘油的应用范围
甘油，学名1，2，3-丙三醇，简称丙三醇，是一种无毒、无臭、无腐蚀性、无色或微黄色、味甜并具有较强吸湿性的透明粘稠液体。甘油是重要的工业原料，在国防、化工、油漆、食品、日化、医药、农药及生物制品等领域有着广泛的应用。
在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程菌的发酵密度，提高产品生产率的关键。在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一。此外，甘油能与水结合以防止红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等。由于甘油用途很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。
（2）甘油在基因表达中的作用
毕赤酵母 ( Pichia pastoris) 作为一个越来越重要的表达系统，已成功应用于数百种外源蛋白的高效表达。 其表达外源蛋白的发酵过程一般有三个阶段：甘油相批培养 (glycerol batch culture) 、甘油流加培养 (glycerol fed2batch culture) 和外源蛋白表达又称为甲醇流加诱导培养 ( methanol fed2batch cul2ture) 阶段。 甘油流加培养阶段非常重要，一方面是为了是菌体在诱导前达到一定的酵母细胞生物量 ,另一方面是通过限制流加甘油补料，消耗批培养产生的如乙醇乙酸类 AOX 酶抑制剂的代谢物，从而有利于 AOX 酶启动子的诱导 ，为甲醇诱导作准备 ,使细胞从甘油相顺利向诱导相过渡。
（3）准确检测甘油浓度的重要性
甘油补入速率的控制往往是一大困难 ,过慢补料使菌维持菌体所需能量相对增加 ，细胞生长减慢 ;补料过快则使得补入的碳源极易产生代谢物在发酵液中积累 ,有毒性 ,并且 ,高浓度的甘油还会抑制细胞生长。 另外 ，甘油相的补料时间最少得 1h ,也可在通过长时间甘油补料增加诱导起始细胞生物量，但是过高的细胞密度会引起细胞死亡率和蛋白酶增多 ,影响目的蛋白产量。

甘油常作为共基质，在甘油激酶、甘油磷酸脱氢酶和丙糖异构酶的作用下，转化为甘油醛-3磷酸，进入糖酵解途径并最终生成丙酮酸，其理论反应途径比葡萄糖更短，转化效率更高。甘油还可以作为可溶性酶体系的溶剂，使得脂肪酶活力更高、活性更稳定。在谷氨酸发酵时添加甘油，发现甘油不是作为碳源，而是作为保护剂增强细胞对环境的抵抗力和维持关键酶的活性，提高发酵的稳定性。
无机盐发酵培养基中的甘油浓度为 40 g/ L,实验证明在摇瓶和发酵罐中初始培养基中甘油浓度降低至 5 g/ L ,待甘油耗尽后及时补料 ,能很大程度上缩短毕赤酵母延滞期 ,促进毕赤酵母生长。补料分批发酵 ,培养基中甘油积累到一定程度会造成底物反馈抑制 ,使毕赤酵母生长速度放慢甚至停止生长 ,所以在流加过程中要控制甘油补加速度 ,使培养基中甘油浓度在限制性浓度以下。可以根据甘油分析仪的检测值 ,通过调节补料速度来精确控制甘油浓度。

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精确控制甘油浓度，节省原料成本