微生物鉴别方法

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一、微生物鉴别方法——传统方法
在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。
1、形态学特征
（1）细胞形态
在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
（2）群体形态
群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。
2、生理生化反应特征
（1）利用物质的能力
包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。
（2）代谢产物的特殊性
这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。
（3）与温度和氧气的关系
测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。
3、生态学特征
生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
4、血清学反应
很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下（如电子显微镜或生化反应），仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。
用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。
该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。
5、生活史
生物的个体在一生的生长繁殖过程中，经过不同的发育阶段。这种过程对特定的生物来讲是重复循环的，常称为该种生物的生活周期或生活史。
各种生物都有自己的生活史。在分类鉴定中，生活史有时也是一项指标，如黏细菌就是以它的生活史作为分类鉴定的依据。
6、对噬菌体的敏感性
与血清学反应相似，各种噬菌体有其严格的宿主范围。利用这一特性，可以用某一已知的特异性噬菌体鉴定其相应的宿主，反之亦然。
二、微生物鉴别方法——新技术新方法
1、细胞壁组分分析
细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中，把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来，有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析，根据细胞壁的氨基酸组成，将其分为6个细胞壁类型，又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型，在此基础上，结合形态特征提出了相应的科属检索表。
2、红外光谱IR
一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同，可以初步认为它们是同一种物质。因此，红外光谱技术被应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类，近年来又应用于放线菌分类中。
根据有关学者的试验表明，这种方法简便快速，样品少，结果较好，不仅可以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质，同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。但是它也有不足之处，借助于红外线光谱区分属内的种和菌株是困难的，但可以作为“属”的分类特征。
3、气相色谱GC
4、高效液相色谱HPLC
5、质谱分析MS
三、微生物鉴别方法——分子生物学方法
1、DNA碱基比
DNA碱基比[（G+C）mol%]，以G+C物质的量分数（mol%）表示：
（G+C）mol%=（G+C）/（A+T+G+C）%
该比值的变化范围很大，原核生物变化范围是20-78%，真核生物的变化范围为30%-60%。
目前已经测定了大量生物的DNA碱基组成，从中可以发现一些带有规律性的结论：①亲缘关系密切而表型又高度相似的微生物应该具有相似的DNA碱基比；不同微生物之间的DNA碱基比差别很大，则表明它们之间亲缘关系疏远。②DNA碱基比相同或相似的微生物并不一定表明它们之间的亲缘关系就一定相近，这是因为DNA碱基比只是指DNA中4种碱基的含量，并未反映出碱基在DNA分子中的排列顺序。③一般认为，DNA碱基比相差超过5%就不可能是属于同一个种，DNA碱基比相差超过10%可考虑是不同属。
DNA碱基比可用化学方法或物理方法测定。由于化学方法比较费时，而且误差也较大，因此目前比较常用物理方法进行测定，尤其是热变性温度法。该法操作比较简便，重复性较稳定，常被作为首选而采用。该法是用紫外分光光度计测定DNA的熔解温度（Tm）。它的基本原理是：首先将DNA溶于一定离子强度的溶液中，然后加热。当温度升到一定的数值时，两条核苷酸单链之间的氢键开始逐渐被打开（DNA开始变性）分离，从而使DNA溶液365紫外吸收明显增加；当温度高达一定值时，DNA完全分离成单链，此后继续升温，DNA溶液的紫外吸收也不再增加。DNA的热变性过程（即增色效应的出现）是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度或熔解温度。在DNA分子中，GC碱基对之间有3个氢键，而AT碱基对只有2个氢键。因此，若细菌的DNA分子G+C含量高，其双链的结合就比较牢固，使其分离成单链则需较高的温度。在一定离子浓度和一定pH的盐溶液中，DNA的Tm值与DNA的G+C含量成正比。因此，只要用紫外分光光度计测出一种DNA分子的Tm值，就可以计算出该DNA的G+C含量。
2、核酸的分子杂交
前面已经谈到，亲缘关系相近的微生物，其DNA碱基比相同或相近。反之则不然，也就是说，DNA碱基比相同或相近的微生物，其亲缘关系并不一定相近。这是因为DNA碱基比的相同或相近并不反映碱基对的排列顺序相同或相近，而微生物间的亲缘关系主要取决于它们碱基对的排列顺序的相同程度。因此，要确定它们之间的亲缘关系就要进行核酸的分子杂交试验，以比较它们之间碱基对序列的相同程度。核酸的分子杂交试验在微生物分类鉴定中的应用主要包括DNA-DNA分子杂交和DNA-rRNA分子杂交等方法。
①DNA-DNA分子杂交：该方法的基本原理是利用DNA双链解离成单链（变性），单链结合成双链（复性），碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外解链，并在合适的条件下使单链中的互补碱基配对结合成双链DNA。然后根据能生成双链的情况，测定杂合百分比。如果两条单链DNA的碱基序列完全相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率100%；如果两条链的碱基序列只是部分相同，则它们生成的“双链”含有部分单链，其杂合率小于100%。因此，杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。许多资料表明，DNA-DNA杂交最适合于微生物种一级水平的研究。根据约翰逊1981年的试验指出，DNA-DNA杂交同源性在60%以上的菌株可视为同一个种，同源性低于20%者为不同属的关系，同源性在20-30%之间可视为属内紧密相关的种。
核酸的分子杂交的具体测定方法很多。按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类，前者在溶液中进行，后者在固体支持物上进行。在这些方法中，有的需要用同位素标记的DNA，有的则用非同位素标记。在细菌分类中，常用固相杂交法进行测定。这种方法的大致做法是：将未标记的各微生物菌株的单链DNA预先固定在硝酸纤维素微孔滤膜（或琼脂等）上，再用经同位素标记的参考菌株的单链DNA小分子片段在最适复性温度条件下与膜上的DNA单链杂交；杂交完毕后，洗去滤膜上未配对结合的带标记的DNA片段；然后测定各菌株DNA滤膜的放射性强度。以参考菌株自身复性结合的放射性计数值为百分之百，即可计算出其他菌株与参考菌株杂交的相对百分数。这些百分数值即分别代表这些菌株与参考菌株的同源性或相似性水平，并以此数值来判断各菌种间的亲缘关系。
②DNA-rRNA分子杂交：DNA中（G+C）mol%测定和DNA-DNA分子杂交方法为微生物种和属的分类鉴定研究开辟了新的途径，解决了以表型特征为依据所无法解决的一些疑难问题。但是对许多属以上的分类单元的正确关系仍不能解决。因为许多研究表明，当两个菌株的DNA配对碱基少于20%时，DNA-DNA分子杂交往往不能形成双链，因而限制了DNA-DNA分子杂交方法在微生物种以上单元分类中的应用。要解决这个问题，就要研究RNA的碱基序列，需要用rRNA与DNA进行杂交。RNA是RNA转录的产物。在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。DNA-rRNA杂交和DNA-DNA杂交的原理和方法基本相同，都是利用核酸复性的规律。但两种方法也有差异：
A. 在DNA-rRNA分子杂交中，同位素标记部位在rRNA。
B. DNA-rRNA分子杂交结果是以Tm值来表示。Tm值越高，表示亲缘关系越近。
③核苷酸序列分析从本章第一节可以看出，16SRNA大分子在生物进化研究中起着重要的作用。伍斯就是根据对60株细菌的16SRNA的核苷酸序列分析研究后，提出了生命的第三种形式---古细菌。16SrRNA序列同源性的应用不仅发现了古细菌，同时还揭示了细菌域各群间的系统发育关系，修正了许多细菌的分类地位，提出了不同于传统细菌分类体系的新的分类系统。新的分类系统体现了微生物分类的研究从表观特征向系统发育体系的发展。新的细菌分类系统与传统的细菌分类体系相比，也存在较多的差异，这主要表现在：
A、改变了细胞壁结构作为亲缘关系划分的标志之一，如无细胞壁的支原体，实际是革兰氏阳性的芽孢梭菌的一个后代分支。
B、改变了营养类型作为种系发生的特征，如光合细菌并非是独立于非光合种群的进化分支，而是每种光合种群都代表了一个高阶的分类单元，其后代分支包括非光合细菌。
C、尽管革兰氏阳性细菌是系统发育关系密切的一群细菌，但革兰氏阴性菌却包括了10个亚群。
应用16SrRNA核苷酸序列分析法进行微生物分类鉴定，首先要将微生物进行培养，然后提取并纯化16SrRNA，进行16SRNA序列测定，获得各相关微生物的序列资料，再输入计算机进行分析比较，由计算机分析微生物之间系统发育关系并确定其地位。
16SrRNA核苷酸序列测定和分析方法可分两类：16SrRNA寡核苷酸编目分析法和16SrRNA全序列分析法。
16SrRNA寡核苷酸编目分析法的大致做法如下：从培养的微生物中提取并纯化16SrRNA，再将纯化的16SrRNA用核糖核酸酶（如T1核酸酶）处理，水解成片段，并用同位素体外标记（也可以在培养微生物时进行活体标记），然后用双向电泳层析法，分离这些片段，用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置，根据寡核苷酸在图谱中的位置，小片段的寡核苷酸分子序列即可确定。对于不能确定序列的较大片段核苷酸，还需要把斑点切下，再用不同核糖核酸酶或碱水解，进行二级分析，有的可能还要进行三级分析，直至弄清所有片段的序列为止。在此基础上，对6个或更多核苷酸的片段按不同长度进行编目。将所有要比较的微生物的序列目录编好后，即可对这些序列目录资料进行分析比较，采用相似性系数法比较各微生物之间的亲缘关系。相似性系数法是通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系。
如果SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同，两菌株亲缘关系相近，若SAB值小于0.1，则表明亲缘关系很远。
寡核苷酸编目分析法只获得了16SrRNA分子的大约30%的序列资料，加上采用的是一种简单相似性的计算方法，所以其结果有可能出现误差，应用上受到一定限制。随着核酸序列分析技术的发展，20世纪80年代末又陆续发展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。这种方法用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行直接的序列测定。
数值分类法是根据数值分析，借助计算机将拟分类的微生物按其性状的相似程度归类的方法。
（1）数值分类法的主要分类原则
该法主要的分类原则是：①分类时视每个性状为同等重要，以避免分类者的主观偏见，使结果比较客观。②根据尽可能多的性状分类，以揭示分类单位间的真实关系。③按性状的相似度归为等同分类单元。
（2）数值分类法的基本程序
数值分类法的基本程序如下：
①分类对象与性状的选择：数值分类时，分类对象可能是菌株，也可能是种或属，所以称每个分类对象为一个操作分类单位。很多场合下，OTU是指菌株。数值分类时，应根据工作目的认真地选择菌株，其中须包括与该分类单元有关的分类单元的模式菌株。如有可能，新近分离的菌株与世界不同地区的菌株也应包括在内。
为达到更客观和精确区分的目的，选择的性状应尽可能多，通常不应少于50个，多者可达上百个甚至几百个。一般地说，所选性状数目越多，分类结果越可靠。所选性状应是尽可能广泛而又均匀地遍布于所研究的微生物中，形态的、生理生化的、生态的、免疫的、遗传的等性状都可以。但要注意，无意义性状和全同性状不宜选用，相关性状如运动性与鞭毛也不能同时选用。
②性状编码将观察和测得的性状用计算机所能识别和运算的符号记录下来。以分类中用得最多的两态性状，如对某种碳源利用与否，有无某种酶，能否在45°生长等为例，阳性结果（能利用某种碳源，有某种酶，能在45°生长等）用“+”表示，阴性结果用“-”表示。如资料缺乏或可疑，可用“NC”表示。对于定量多态性状或定性多态性状采用加权递增编码法，将1个多态性状转化成多个3态性状。将性状编好码后，把它们排列成顺序号，形成一个性状（原始数据）矩阵，然后输入计算机。输入计算机时分别用1和0表示，“NC”输入计算机时用“3”代表。
③相似度系数的计算：相似度系数是被比较的OTU对偶间整体相似程度的度量，它是根据每一对性状的相似程度计算出来的。计算相似度的方法很多，最简单的方法是计算对偶间相似性状的数目。
其计算公式如下：
S=NS/（NS+ND）
上式中的NS表示比较的OTU对偶有相同性状的数目，ND表示被比较的OTU对偶有不同性状的数目。算出的相似度以百分数或比例表示。
④系统聚类（或等级聚类）：根据相似度系数对OTU进行系统（或等级）聚类归群，得到相似度矩阵，即S矩阵。如对10个菌株进行数值分类，经过系统聚类可得到S矩阵，相似度为百分数，100表示每个OTU自己与自己相比。
⑤聚类结果的表示：从矩阵看不出这10个菌株间的相互关系，因此需要对矩阵进行重新处理，将相似度高的和低的分别列在一起，得到另一组矩阵。
然后再由此矩阵转换成能显示这10个菌株相互关系的树状谱。数值分类得到的是表观群。实践证明，表观群是等同于分类单元的。大约是75%相似度的表观群可视为同一种，比值达65%以上者可归入同一属。这样的结论和传统分类方法的结果通常是一致的。