防治奶牛乳房炎的基因工程新药

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奶牛乳房炎是世界范围内发生最普遍、防治最难、花费最多的奶牛疾病之一，对奶牛业的危害主要是发生率高、奶产量降低和医药费用增加。目前奶牛乳房炎主要用抗生素防治，虽有一定的效果，但也日益暴露出耐药菌株和抗生素残留等危害人类健康的严重问题，特别是在我国，由于抗生素的长期、大量和盲目使用，治疗奶牛乳房炎无效的病例越来越多，从而给奶牛业造成了很大的经济损失。扬州大学江苏省转基因动物制药工程研究中心将基因治疗原理与溶菌酶的广谱抗菌作用相结合，研制出能取代抗生素防治奶牛乳房炎的基因工程新药，并已获得国家发明专利（专利号：ＺＬ０２１４８５４５．３），目前处于安全评价的中间阶段，现介绍如下。
一、有效成分
本基因工程新药的主要成分是表达人溶菌酶基因的动物乳腺定位表达重组载体，用自行设计的纯化方法从工程菌发酵培养物分离所得，与一定浓度的磷酸盐混合后，可在室温下保存１个月以上，低温下可长期保存。
二、作用原理
溶菌酶是人和动物天然的非特异防御因子，对多种革兰氏阳性菌具有直接溶解作用，在补体和抗体的协助下对革兰氏阴性菌也有溶解作用，同时还具有一定的增强机体免疫力、消炎、化脓和促进组织修复等功能，因此非常适合病原菌复杂的奶牛乳房炎的防治。将基因工程药物经乳池或乳腺基部注射入奶牛乳腺组织后，部分重组载体将被乳腺细胞吸收，在泌乳激素的调节和乳蛋白基因启动子的驱动下，乳腺细胞表达和分泌重组人溶菌酶。
三、特点
与现有的方法相比，此种基因药物防治奶牛乳腺炎具有以下优势：
１．因表达的溶菌酶对多种乳房炎致病菌具有溶菌作用，对治疗病原菌复杂的奶牛乳房炎具有更好的针对性和效果；
２．注射的基因药物被乳腺细胞吸收后能维持较长（至少１０天）的表达和治疗时间，不需反复用药；
３．基因药物按照人基因治疗的要求设计，纯化制品中细菌基因组ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白和内毒素的含量符合相关标准，使用安全；
４．分泌到牛乳中的人溶菌酶是天然的非特异防御因子，对人体有益无害，基因药物在牛乳中的残留时间短暂，即使有微量残留也能很快被消化道完全降解，所以无有害残留问题；
５．溶菌酶的作用机理不同于现有的抗生素和化学药物，不易产生耐药性；
６．基因药物从工程菌发酵培养中分离所得，发酵用培养基和重组载体纯化方法均由本研究室自行设计，所以便于工厂化生产，生产成本能被兽医临床接受。
四、安全性试验
用１００微克溶解在磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中的基因药物肌肉注射实验小鼠，注射后连续观察５天?５只小鼠未出现不良反应和死亡现象；用１．３毫克溶解在ＰＢＳ中的基因药物肌肉注射初生犊牛?注射后连续观察５天?５头犊牛未出现体温升高和异常临床表现；将２００微克溶解在ＰＢＳ中的基因药物注射入患乳腺炎奶牛乳腺?注射后连续观察１周，５个乳区未出现异常临床表现。
取基因治疗后牛乳进行基因药物残留检测，结果仅在注射后第２天ＰＣＲ检测为阳性。
用１００微克基因药物灌喂小鼠，然后用电泳和ＰＣＲ扩增法检测消化道内降解动态，结果在小鼠的胃内，基因药物１分钟内即完全降解。
这些试验结果表明，注射基因药物对实验动物和奶牛是安全的，在牛乳中的残留是短暂的，即使有微量残留也能被消化道快速降解。
五、临床应用
?一）针对隐性乳房炎
用国际标准的加州乳房炎测定法（ＣＭＴ）检测奶牛乳汁，将反应判为＋＋＋的奶牛乳区分成四组，第一组乳池内注射２００微克基因药物，第二组乳房基部注射２００微克基因药物，第三组乳池内注射１００万单位青霉素和２５万单位链霉素，第四组乳池内注射１５毫升中药乳炎消，每天注射１次，共注射３次。以ＣＭＴ反应下降１个以上＋号为判断依据，用药一周后四个治疗组的有效率分别为８／８、６／６、５／５和８／１０，十天后的有效率分别为７／８、５／６、５／５和６／１０；四个治疗组乳汁的细菌总数、金黄色葡萄球菌数、链球菌数和大肠杆菌数均较治疗前有明显下降；在治疗期间的７天内，四个治疗组的平均产奶量分别较治疗前增加３．７５、２．９１、２．７３和１．９３公斤／头／天；在随后的７天内，四个治疗组的平均产奶量分别较治疗前增加１．５１、２．７９、２．７９和０．３３公斤／头／天。这些试验结果表明，基因药物治疗奶牛乳房炎的效果与抗生素合剂接近。
（二）针对经抗生素治疗无效的乳房炎
在第一次治疗试验中，选择抗生素治疗无效的临床型乳腺炎乳区１８个，乳池内注射基因药物２毫升（２００微克），每天注射１次，共注射３次。结果在注射后第七天时，除１个乳区的临床症状无改善外，其余乳区的临床表现均有不同程度的减轻，包括红、肿、热、痛消失，乳汁颜色及ｐＨ恢复正常；ＣＭＴ检测结果显示，治疗有效率为８３．３％（１５／１８），治愈率为２７．８％。在另一次试验中，将抗生素治疗无效的２９个乳区分为两组，一组（１８个乳区）为临床型乳房炎组，乳汁体细胞数在５００～９９９万之间，另一组（１１个乳区）为隐性乳房炎组，乳汁体细胞数小于２００万，每乳区基部注射４毫升（４００微克）基因药物，次日重复注射１次。结果在注射后的第２、５、１０天，临床型乳房炎组体细胞下降１００万以上的乳区分别为６５％（１１／１７）、８３％（１８／１５）和７８％（１４／１８），转为隐性乳房炎的乳区分别为２９％（５／１７）、２８％（５／１８）和６１％（１１／１８），治愈率为２２％（４／１８）；在相同的时间内，隐性乳房炎组的治疗有效率分别为４５％（５／１１）、８２％（９／１１）和８２％（９／１１）。这些试验结果表明，基因药物对经抗生素治疗无效的顽固性乳房炎也有一定的治疗效果。
六、使用方法
该基因药物可用于乳池和乳腺基部两种途径注射，以乳腺基部注射效果为佳。
在进行乳池注射时，先对乳头进行消毒，并挤净患病乳区的乳汁，然后用灭菌注射器吸取５０毫升ＰＢＳ液或生理盐水，经乳导管注入乳池中，轻轻按摩乳房后挤出，如此重复冲洗乳池，最后将４毫升稀释好的基因药物用乳导管注入乳池中，轻轻按摩乳房使之分布均匀，次日重复注射１次。
基因药物的乳房基部注射方法与常规的乳房基部封闭法相似，先用碘酒棉球消毒乳区基部皮肤，经用酒精棉球脱碘后，在保定的情况下用约１０厘米长的穿刺针，将４毫升稀释好的基因药物注射到每乳区与腹壁之间的夹层中，进针时应避开乳静脉等大血管，以免出血，最后轻轻按摩乳房使药物分布均匀，次日重复注射１次。在第一次治疗后１０天左右，视具体情况考虑是否进行再次治疗，方法同前。
无论采取哪种注射方法，都必须注意用具消毒和更换注射针头或导管，以免发生交叉感染。
七、推广前景
目前奶牛乳腺炎不仅发生率高，而且国内外没有理想的防治方法。长期和大量使用抗生素导致牛乳中抗生素的大量残留，但至今尚无真正能替代抗生素的新药。特别是在我国欠发达地区和经济条件欠佳的奶牛场，由于经济实力和条件的限制，在治疗奶牛乳房炎前，临床兽医很少进行必要的药敏试验，大量和盲目使用抗生素已导致治疗无效乳房炎病例越来越多。这些顽固性乳房炎患牛一般都作淘汰处理，每淘汰一头就意味着逾万元的经济损失。此次研制的基因工程新药不仅能替代抗生素用于奶牛乳房炎的防治，满足生产“无抗奶”的需要，而且对抗生素治疗无效的顽固性乳房炎也有良好的治疗效果，一次治疗即能挽救３０％左右的患牛免遭淘汰。随着相关研究的不断深入和基因药物及使用方法的不断改进，治疗效果还可进一步提高。