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[建议] 感受态Stbl3应用和操作方法

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  • TA的每日心情

    2021-10-19 14:53
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    [LV.3]偶尔看看II

    发表于 2021-9-30 13:38:25 | 显示全部楼层 |阅读模式
    M-100系列生物传感分析仪快速、精确测定葡萄糖
    Stbl3感受态细胞来源于 HB101 E. coli strain,是慢病毒载体系统推荐使用的菌株,可有效抑制长片段末端重复区的重组,降低低错误重组的概率。经pUC19检测转化效率108 cfu/μg DNA。一般医院使用比较多。

    ▶ 操作方法

    一 、热激转化法

    1.从-80℃冰箱取出感受态细胞冰浴融化后,吸取100μl感受态细胞转移到-20℃过夜预冷的摇菌管中,加入质粒或连接产物,轻轻混匀,在冰浴中放置30分钟。

    2.42℃水浴热激60秒,迅速放回冰中并静置2分钟,该过程不要摇动摇菌管。

    3.向摇菌管中加入900μl 37℃温浴的SOC或LB(SOC培养基可提高2-3倍转化效率),37℃、180rpm、45分钟复苏菌种。

    4.根据实验要求(质粒,重组连接产物转化),吸取不同体积已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB琼脂培养基上,将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收,倒置平    板,37℃过夜培养。

    二、10分钟快速转化法

    注:在使用卡那霉素,四环素等作为筛选抗性时,需要在SOC培养基中复苏以提高转化效率,当使用氨苄青霉素作为筛选抗性时,该步骤可以省略。感受态细胞-DNA混合物在冰上孵育5-10分钟后加入4倍体积的37℃温浴的SOC培养基,在37℃ 180rpm孵育1小时,然后转移到37℃预热的LB培养基上。

    1. 提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

    2. Stbl 3感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀,冰中静置5分钟。

    3. 用200μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上,涂均匀,表面无水渍。

    4. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。



    ▶ 注意事项

    1. 刚刚化冻的细胞,转化效率最高。

    2. 避免反复化冻。

    3. 避免移液枪吹吸。

    4. 整个操作过程要轻柔。

    5. 重组产物不建议用10分钟快速转化法。
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