TA的每日心情 | 怒 2020-6-29 17:24 |
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发表于 2011-12-11 14:25:28
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4:纯化方法评价
PC 抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取),以及低浓度核酸的醇沉淀效率低,但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。
PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性,变性后的蛋白质从水相中被析出,处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是,一要混匀彻底,二要用量足够。彻底混匀,才能确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸,尤其是基因组 DNA 造成破坏,实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作,是会部分打断大分子的基因组 DNA,但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后,基因组 DNA 的片段,大部分会大于 20kb,这个大小,除了一些特别的要求外,对 PCR 和酶切,都是完全适用的。如果要求的片段非常大,如构建文库用,则不能使用剧烈的混匀方法,而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是:裂解液的比例要足够大,使体系不要太粘稠。用量要足够,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度,裂解体系中的蛋白质不会被一次去除,必须靠多次抽提,方可彻底去除。另外,体系太粘稠的坏处是,蛋白质难以彻底去除,以及基因组 DNA 会断裂得更厉害,所以要注意裂解液与样品的比例。4C 离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是,利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点,在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是,有些植物样品,在去除某些杂质之前,是不能使用 PC 抽提的,否则核酸必定降解。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法,同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比,除了纯度的稳定性可能要低一点外,该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是,可以用于大规模抽提,不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。
介质纯化方法,是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,并且因为受人为操作因素影响小,纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大,都是通过数次的加液-倒液过程,干燥后,溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程,但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中,与含有核酸的柱子完全是分开的,所以洗涤更彻底,操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了,或者液体的残留)。不过,介质纯化方法的成本是最高的。
5:醇的沉淀
醇的沉淀,目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中,许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来,尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的,任何有机大分子及一些盐,当浓度达到一定水平后,都可能同步被沉淀下来。
就核酸而言,标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量,但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现,当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后,即使体系中不含教科书中建议的盐,单独使用醇也可以使核酸沉淀下来;或者含有盐,使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然,得率可能会降低)。知道这一点的意义在于:不要迷信标准方法的唯一性;相反,当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题 – 时,完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案:一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇,可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是,要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程;调整醇沉淀的条件,虽然会降低核酸的得率,但因为可以大大提高纯度。
如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的,原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率:当核酸浓度很低时,效果明显;当核酸浓度比较高时,效果不明显,但却会导致杂质的大大增加。
醇沉淀使用异丙醇还是乙醇,我没有发现这二者对质量有大的影响,虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑,帖壁紧,颜色不是很白;乙醇沉淀的核酸比较蓬松,容易从壁上移动,颜色比较白。这是现象,提示结论:异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉,但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑,则建议:少量核酸用异丙醇沉淀 (量少,洗涤不是问题,不丢失为先),大量核酸用乙醇沉淀 (量大,丢失不是问题,洗涤方便为先)。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法,我没有碰到过 (我几乎不使用低温沉淀,难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀?);我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。
当然,也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小,可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑,洗涤时其中心部分不容易被洗涤到,所以,洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是:一定要使沉淀悬浮起来,一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次,质量决不会有问题的。
PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率,但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。
6:洗涤
洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要有一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松);第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”,这一描述本身没有问题,且十分方便,但因为他来自国外,自然就有了“水土不服”的问题。如果离心管是经过硅化的,因为液体几乎不挂壁,所以上清可以去除得非常彻底;好的管子,即使没有经过硅化,残留量也非常少,也没有什么问题;差的管子,液体的挂壁非常可观,其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响的操作,就是倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出。一定要牢记的是,残液中都含有上一步操作中的杂质,其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇,杂质是不会被挥发去除的。
另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越强,洗涤越要彻底:放置时间相对要长一点,洗涤次数也要考虑增加。最关键的,洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。
7:核酸的溶解和保存
纯化后的核酸,最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解;其中 RNA 以水为主,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。
基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现,-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的稳定,我却宁可认为这是个例。
如果温度合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定,而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的,就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP 管的材质,首先可能吸附核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。
现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料,在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多,但其化学特征,尤其是对核酸稳定性的可能影响,远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样,其负面产物可能是,抽提的质粒电泳的构型越来越多:除了原来的三种带型外,还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。
8:核酸质量的检测问题
将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;除此之外的检测方法,都是相对的,而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围),该方法还是非常可信的;电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息,但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度仪不能确保非常准确,而该仪器的灵敏度又非常高,所以,提供的结果并不十分可信。一般讲,同时进行紫外和电泳检测,综合二者的结果,可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷,所以,即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验,也不用大惊小怪。
关于紫外分光光度仪的检测。首先,不要使用不能选择波长的仪器;使用那些已经固定了波长的仪器,大概可以算是你梦魇的开始。(没有信息是可怕的,更可怕的是将错误的信息当真。) 其次,一定要经常调较仪器;调较可以使用非常纯的自备核酸,也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法,非常简单;具体道理可以见我以前的帖。) 最后,要记住读数 A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1 为理论上的数据,实际测定时会有一些差别;但如果差别太大,就有问题了。有两个值得商榷的观点:如果 A260/A230 > 2 就是纯的,如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多,一定是有杂质残留的 (具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定,A260/A280 > 2.3 决不提示核酸降解,原因是:那些能导致 A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小,常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的;更可能的原因是:你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值,在 A230 是谷底,在 A260 是峰顶,在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小,在半山坡的斜率最大的特点,不难得出如下结论:A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小,而 A280 受仪器准确性的影响比较大。
建议先电泳检测,再用紫外分光光度仪检测。电泳后,可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害),以及核酸的大致浓度,这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了,要测的该取多少量等)。 |
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