固态发酵发酵车间如何灭菌

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随着微生物在酵母饲料、酵素蛋白饲料、复合酶制剂、复合饲用微生态制剂(益生素)等的固态发酵饲料制品中的应用和发展，一些不利和有害微生物在生产中的污染问题也显得愈来愈突出，它们严重影响生产的正常运行和产品品质。无疑，这也是各个生产单位的重要研究课题之一，尤其是对于较粗放和敞开式固态发酵方式来讲，防治杂菌污染实际上是关系到整个发酵饲料行业走向正常生产管理轨道，获得较为纯净的生物制品的非常重要的一个方面。　　  笔者认为，治菌不如防菌，对于不利和有害微生物的污染必须采取综合的防治措施。例如注意清洁卫生，选择性地控制有害微生物生长繁殖的物理化学环境，采用必要的防腐(细菌)和防霉(霉菌)剂，以及严格制定杀菌消毒制度等，这些都是相辅相成的。本文就笔者多年来在国内数家固态发酵单位从事技术指导工作时在杂菌防治方面的一些浅陋经验作一简单介绍。
1　微生物污染的来源及其危害
1.1　空间环境　　
发酵饲料生物制品的生产大多使用曲霉、酵母和一些细菌作为菌种，它们都是各厂家根据自己的生产目的而分离筛选出的“需要的”有用微生物菌种。广义而言自然界还包括不同属性各种性状的酵母、霉菌、细菌、放线菌；还有病毒、立克次氏体、原生动物和藻类等，它们有的对发酵有益，有的对发酵有害甚至是人类的致病菌。不论是有益还是有害，只要不是厂家需要的目的菌，它均属于“杂菌”范畴。　　
我们的防治目的主要还是针对有害菌。微生物都很微小，容易附着在人体或物体上，以人为载体到处移动，并从人体或物体上分离到空气中，附着在灰尘上，到处漂浮。所以，空气中的杂菌源自于空中的灰尘，车间的灰尘颗粒洁净度，即象征着无菌程度。　　
空气中的杂菌非常复杂，对于有严格防菌制度的菌种室而言，空气中微生物大都为生产中使用的酵母、曲霉孢子或细菌，杂菌较少。但在操作中稍有不慎，也会造成一、二、三级种子污染，进而在四级种子敞开培养时，表现为大量污染而无法使用。污染菌大多为高温杆菌、黑根霉等，严重时出现异味，造成停产待种。空气环境中杂菌对成品发酵的影响相对较小。
1.2　原材料污染源　　
在各类油料饼粕、麦麸、玉米粉、食品及酿造行业下脚料、鱼粉中，含有大量的霉菌孢子，多为黑根霉，在鱼粉中更是含有沙门氏菌和绿脓杆菌等致病性芽孢杆菌，在较潮湿的环境中及含水较高的培养料上生长极快，原料中又以麦麸的根霉孢子含量最多。当用鱼粉作原料之一时，一定要在121℃的温度下灭菌30min以上才能保证生产安全。　　
生产中若灭菌不充分，或经常在菌种室区域搬运及使用麦麸等原料，极易造成制种阶段污染根霉，在使用100%麦麸作制种培养基时，严重的造成里外皆霉，防不胜防。在使用浅盘法生产菌种时，料厚若高于8cm，则易造成物料内层的厌氧和高温环境，滋生大量杆菌，并产生异味。当然，这也与上一级种子质量优劣有关。
1.3　人体污染源　　
在按严格无菌制度操作的菌种室和有无菌处理要求的场所，发生污染的最大可能原因是由人体上的微生物混入空气中而造成的，在1d内人体可以释放出几亿个菌，尤以头发中最多。　　人体主要微生物分布为：头发和头皮中有许多葡萄球菌，棒状杆菌及其它革兰氏阳性细菌；手掌上常有葡萄球菌和芽孢杆菌等；口中常检出有葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌等；耳、鼻、眼中有葡萄球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌及革兰氏阳性细菌等；人的皮肤表面的菌亦很多；衣服及物品上微生物的类型及数量则更多；另外还附着有大量霉菌孢子。由于每个人所保持的清洁度不同，其数量有很大差别。　　
在种子制作阶段，这些微生物很容易进入种子中造成污染。葡萄球菌是一种极难控制的有害细菌，由于某些球细菌的生长繁殖条件与耐渗透压的生产用酵母相似，故而常常在发酵阶段大量繁殖，使产品出现极为不爽的气味，严重降低产品品质。实际上在PH为4.5～5.5的高蛋白基料及高渗水平上的固态发酵常出现的污染是球细菌，而极少污染霉菌和杆状细菌。人体则是造成球细菌污染的根本和主要原因。
1.4　其它污染源　　
许多污染源也是相互关联的，例如空气中的杂菌最难控制，它们来源于物料、物品及人的活动，并漂浮于空气中。所以最有效的防范措施在于严格的卫生制度和行为约束制度，然后才是严格的空间消毒杀菌和原料灭菌规程，并注意生产车间的周围环境。


2　污染的检测
2.1　用沉降法检测空气中微生物　　
2.1.1操作过程　制备好固体培养基平板，当需要测定空间某处杂菌污染情况时，打开培养皿盖，暴露一定时间；盖上培养皿盖，于适宜温度下，倒置培养一定时间，观察比较菌落的多少，镜检菌落的类别。　　
2.1.2注意事项　要分别制备细菌、霉菌等培养基平板，分开测定；暴露的时间根据具体情况而定，空气干净则暴露时间长一些，反之时间短一些；此法只能说明空气中杂菌污染的大致情况，不能计算空气杂菌密度；测定的高度、部位视具体情况而定，在同一房间中，最好分开放置几个培养皿。

2.2　接种法计算空气中杂菌密度　　
准备好一定体积的无菌水，将一定体积的空气全部通过无菌水，微生物则被阻留在水中，用一定量的该水接种到培养皿中，进行培养，观察长菌情况，将数得的菌落数进行换算，即可得单位体积空气中的杂菌数。


2.3　原料、人体、污染源中杂菌定性观察　　
可采取简单的取样、定量定容、无菌地接种到平板上，培养并进行观察鉴别和计数。

2.4　生产中杂菌检测观察结论(见表1)
表1　杂菌污染情况及根本来源(或“宿主”)　
% 污染物 黑根霉 葡萄球菌 杆状细菌 其它 合计
一级种子 5 80 14 1 100
二级种子 10 80 8 2 100
三级种子 80 15 4 1 100
四级种子 90 5 4 1 100
发酵生产 10 80 8 2 100
“宿主” 原料 人体 人体、原料 人体、原料 　
注：表中百分比指该杂菌可能造成污染的程度，并非绝对污染。其它指其它霉菌。“宿主”指某杂菌至少90%以上来源于该污染源。　　对于空气而言，一般只是一种将杂菌从人体和物料上污染到生产物料中的中间介质，不是根本的“宿主”，故表中并未列出。　　、
实践证明，对于最终发酵产品而言，好气性球细菌等比较难以控制，许多厂家由于管理不善及技术不过关，使产品细菌含量严重超标。

3　杂菌预防措施

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本文仅就关键的制种阶段的杂菌防治作一简单的介绍，由表1可知，制种阶段易污染黑根霉，严重时使制种无法进行下去，严重影响菌种活力和质量。另外还必须注意葡萄球菌污染，尽管在制种时它不是主要污染菌，但进入发酵阶段则可发展为主要污染菌。球细菌与杆状细菌的防治与操作人员的无菌观念和责任心有很大关系。


3.1　菌种生产工艺条件　　
即培养基配方及培养环境条件，这是首先应考虑到的。微生物的污染是防不胜防的，尽管有最先进的设备，也不能绝对防止它进入培养料中。所以制定一个具有高度选择性的生产工艺条件是上策，更何况我们都习惯于那些比较粗放简单的生产方式。　　

3.1.1配方　生产中切忌采用营养过于丰富或碳氮比极高的培养基配方，在二、三、四级种子阶段采用具有驯导作用的配方是很有效的。例如在以菜粕为主原料的固态发酵生产中，在种子配方中可采用在二、三、四级种子培养基配方中逐步放大菜粕用量的方法，同时配合其它配方技术，既可有效地防止杂菌污染，又可得到较高的细胞含量。同时，种子也得到了三步驯导，有利于发酵生产。　　
过于丰富的培养基的第一个弊端在于细胞生长过旺过快，加上空气扩散速度跟不上，使物料内部产生高温可达50℃和缺氧环境，使厌气性高温杆菌和球菌大量繁殖，产生不良气味。其次，在湿度较高的底部会生长成片的黑根霉菌块。
笔者认为，以油料饼粕、淀粉质原料复配，使基料蛋白含量在25%～35%为宜，同时加入1.5%～5%的无机盐(根据本厂菌种渗透压耐性而定)，来调节渗透压，抑制杂菌生长，必要时加入盐酸溶液以调节PH值到5.0左右。