发酵饲料中乳酸、赖氨酸和可溶性多糖快速检测方法的研究

金玉良缘

发酵饲料中乳酸、赖氨酸和可溶性多糖快速检测方法的研究

发酵饲料指利用某些特殊的有益功能微生物与一种或多种饲料及辅料混合发酵的鲜湿料或经干燥或制粒等特殊工艺加工而成的含活性益生菌的安全、无污染、无药物残留的优质饲料。发酵后饲料中含有大量有机酸、小肽、维生素等，具有营养、保健双重功效。
    微生物发酵饲料的生产与应用是近年来饲料工业和养殖业最热门的话题之一。随着人民生 活水平的不断提高和环境资源的日益 恶化，利用农副产品和轻工副产物生产高质量 、无 污染的微生物发酵饲料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜禽产品品质、减少畜产品药物抗生素残留的重要手段。微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌 、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌3种 。乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微生物发酵饲料。 因此发酵饲料中乳酸含量的高低是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指标。
    乳酸菌厌氧发酵，饲料中的有害菌含量少，安全性好，而且营养和重量损失少。理想的发酵状况是在 24 小时内产生 100mmol 的乳酸，才能确保发酵饲料的安全。然而部分发酵适饲料口性不佳，常由于喜好低温环境的酵母菌主宰发酵过程，饲料虽然安全，但由于酵母菌的活性作用，饲料中含太多的醋酸而丧失适口性。若由乳酸菌种主宰发酵过程，则饲料中主要为乳酸，结果安全又美味。
   乳酸菌最适发酵温度应在 30℃左右，并在几个小时内产生高浓度的乳酸和低浓度醋酸，让饲料pH 达到 4.2 或更低。迅速降低 pH 值是控制发酵的必须条件，更重要的是酸度必须源自乳酸而非醋酸。所以，正确的评估方法应测定乳酸的含量，不能直接凭借 pH 值作判断。发酵饲料的适口性和高酸（低pH）可相容，例如可口可乐 pH 值在 2 左右，人们觉得口味宜人，但相同 pH 的醋酸就难以下咽了。
    饲料经过发酵后蛋白质被分解为更易被动物体消化吸收的小分子活性肽、寡肽。赖氨酸常常是谷物类饲料的第一限制性氨基酸，其需要量是建立猪理想蛋白模型的基础.机体不能合成赖氨酸、且脱氨基后赖氨酸不能更新复原，也不能被任何一种类似的氨基酸所代替，所以，赖氨酸是猪饲料中最易缺乏的氨基酸之一。因此，赖氨酸在猪营养中被认为是第一限制性氨基酸。
无论是厌氧发酵还是好氧发酵，微生物在代谢过程中会产生纤维素酶类，从而将原料中的纤维素、果胶降解为单糖和寡糖等可溶性的容易被利用的富含还原糖的物质，同时代谢产生的多种消化酶、氨基酸、维生素、抑菌物质、免疫增强因子以及其它一些菌体蛋白，作为营养物质被动物体吸收利用，显著提高饲料的营养水平和饲料利用率，从而提高动物体的各项生产指标。
    由此可见乳酸、赖氨酸、还原糖含量可以作为衡量发酵饲料优劣的关键指标。


1、材料与方法
1.1、试验材料  
稻壳粉、醋糟、玉米胚芽粕、麸皮、豆粕均为市售，嗜酸乳杆菌、酿酒酵母菌由本实验室活化所得。乳酸、赖氨酸、可溶性还原糖检测仪器为酶电极催化反应原理，商品名为发酵饲料分析仪。
1.2、试验处理  本实验共三个组别，每个组设置两个处理，每个处理三个重复。第一个处理是接种1%的嗜酸乳杆菌，置于37℃恒温厌氧培养7天，第二个处理是接种1%的酿酒酵母菌，置于28℃恒温厌氧培养7天。
原料
组别        1        2        3
稻壳粉        33%        48%        27%
醋糟        15%               
豆粕        5%        12%       
小麦麸                        10%
玉米胚芽粕        7%                23%
水        39%        39%        39%
菌液        1%        1%        1%
粗蛋白，%        11.7        11.32        11.75
碳氮比        19.88        19.89        19.92

1.3 检测方法
1.3.1 乳酸检测方法
原理：采用特殊设计的乳酸氧化酶膜电化学传感器对乳酸浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的乳酸在固化的乳酸氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为丙酮酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出乳酸含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本乳酸浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
样品测定 ：1 g 发酵饲料溶解于1 0 0 m L蒸馏水中，超声波溶解2分钟，4000 rpm离心 1 0分钟，取上清液1 ml于样品管中。按照仪器操作说明书进行操作
1.3.2 赖氨酸的检测
原理：采用特殊设计的赖氨酸氧化酶膜电化学传感器对赖氨酸浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的赖氨酸在固化的氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出赖氨酸含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本赖氨酸浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
样品检测：
饲料游离氨基酸含量测定样品溶液制备：准确称取适量饲料（使样品中需测定的单个氨基酸含量在5～10mg或总氨基酸含量在100-150mg范围内），置于烧杯中，加0.1mol/L盐酸30mL，搅拌提取15min，静置5分钟，将上清液过滤到100mL容量瓶中，残渣加0.1mol/L盐酸25mL,搅拌3min，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗滤纸上的残渣，收集滤液并加0.1mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。
饲料中总赖氨酸的测定：按照GB/T18246-2000 采用酸水解，对发酵饲料进行处理。
1.3.3 可溶性还原糖的检测方法
原理： 还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。一般以葡萄糖含量表示还原糖的含量。采用特殊设计的葡萄糖氧化酶膜电化学传感器对葡萄糖浓度进行检测。仪器自动采集样本并导入至测试区域。样本中所含的葡萄糖在固化的葡萄糖氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为葡萄糖酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
样品检测：准确称取发酵饲料1g,放入50ml烧杯中,在45℃水浴中加热1h ,并时时振摇，超声波提取10min，加入10ml6mol/L HCl溶液和15ml蒸馏水,混匀,在沸水中加热30min后,待水解完全后,冷却,加入酚酞指示剂,以10%NaOH溶液中和至溶液pH呈中性,滤过并定容至100ml,静置。吸取上清液用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,取后续滤液备用。吸取500微升与样品管中，按照仪器操作说明进行操作。
2.实验结果及分析
不同处理各组的pH
组别        1        2        3
初始pH        5.00        5.05        5.02        6.50        6.45        6.46        6.00        6.00        6.02
处理1（嗜酸乳杆菌）        4.05        4.00        4.07        3.90        3.89        3.87        4.12        4.08        4.10
处理2（酿酒酵母菌）        4.09        4.12        4.20        4.10        4.22        4.00        4.11        4.16        4.10
                                                                       


原料的品种，产地，加工方式，配方比例等对发酵初始pH会有较大影响，从而直接影响微生物的生长环境，对发酵最终pH、产酸率、代谢产物等可能会有一定的影响。下一步我们会设计实验去验证。








不同处理各组的乳酸含量mg/g
组别        1        2        3
初始        1.00        1.05        1.0        0.50        0.50        0.51        0.67        0.69        0.72
处理1（嗜酸乳杆菌）        15.35        17.09        16.04        22.15        22.32        23.00        25.55        24.78        26.09
处理2（酿酒酵母菌）        13.00        12.46        13.44        16.45        17.00        17.18        18.09        18.78        19.00
                                                                       



不同处理各组的可溶性还原糖（以葡萄糖计）%
组别        1        2        3
初始        1.00        1.05        1.02        0.95        0.98        0.90        0.82        0.84        0.79
处理1（嗜酸乳杆菌）        1.32        1.37        1.27        1.90        1.49        1.67        2.12        2.08        1.88
处理2（酿酒酵母菌）        1.54        1.22        1.20        2.10        2.22        2.00        2.51        2.36        2.10
                                                                       


不同处理各组的赖氨酸含量，%
组别        1        2        3
初始        0.13        0.15        0.16        0.40        0.38        0.32        0.24        0.26        0.21
处理1（嗜酸乳杆菌）        0.13        0.14        0.17        0.42        0.39        0.35        0.26        0.28        0.25
处理2（酿酒酵母菌）        0.14        0.15        0.16        0.45        0.46        0.41        0.28        0.27        0.28
                                                                       



传统的检测乳酸的方法有主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法(HPLC）。EDTA定钙法虽然操作简便，检测时间也不太长，但检测准确性最差，误差较大，结果较不可靠，并且发酵饲料中组份复杂，干扰性离子较多。 高效液相色谱法具有专一性强，结果准确可靠等特点，但对于从发酵饲料复杂组份中分离出乳酸，对仪器和操作者的前处理水平都有很高要求，并且检测成本、仪器投资也较高。赖氨酸的检测一般用氨基酸分析仪或者比色法，前处理复杂，检测仪器昂贵。还原糖检测一般采用DNS比色，斐林试剂滴定等常规的化学方法，优点是操作简单，检测成本低廉，缺点是检测时间长，分辨率差，专一性差，发酵饲料中存在较多的干扰因素。鉴于目前发酵饲料企业大多是中小型企业，资金，技术，管理等资源有限，一次性投入高校液相色谱、氨基酸分析仪等大型仪器比较困难。所以选择一种适合当前发酵饲料企业使用，一次性投资少，单次检测成本低，操作简单，检测专一性强的检测方法对于促进发酵饲料工业的健康发展具有重大意义。本文中用到的酶电极的检测方法具有以上有点并且检测速度很快，一个样品耗时一分钟左右能同时检测乳酸、赖氨酸、可溶性还原糖等指标。

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