微生物鉴别方法

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一、微生物鉴别方法——传统方法4 o! {. b: S7 M  j- c5 U7 x
在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。
1、形态学特征3 A, y. R2 t/ U0 x5 q
（1）细胞形态4 c& a: t( u( s' o, }5 z
在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。
（2）群体形态
群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。
2、生理生化反应特征
（1）利用物质的能力
包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。! }+ b) a( B4 v& _. z3 v" |
（2）代谢产物的特殊性
这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。
（3）与温度和氧气的关系" X, P5 ?9 D( M- _. v" W/ `
测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。: T$ _3 |% n  y8 L: A2 `- q3 \
3、生态学特征
生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
4、血清学反应
很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下（如电子显微镜或生化反应），仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。
用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。
5、生活史
生物的个体在一生的生长繁殖过程中，经过不同的发育阶段。这种过程对特定的生物来讲是重复循环的，常称为该种生物的生活周期或生活史。
各种生物都有自己的生活史。在分类鉴定中，生活史有时也是一项指标，如黏细菌就是以它的生活史作为分类鉴定的依据。& p) Q% s/ x. b- r3 i$ c
6、对噬菌体的敏感性4 {" y6 y) I# J+ O% M. \
与血清学反应相似，各种噬菌体有其严格的宿主范围。利用这一特性，可以用某一已知的特异性噬菌体鉴定其相应的宿主，反之亦然。
二、微生物鉴别方法——新技术新方法+ P8 Q! w, F4 O
1、细胞壁组分分析
细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中，把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来，有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析，根据细胞壁的氨基酸组成，将其分为6个细胞壁类型，又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型，在此基础上，结合形态特征提出了相应的科属检索表。
2、红外光谱IR5 O& P" H. i: d# z% D
一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同，可以初步认为它们是同一种物质。因此，红外光谱技术被应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类，近年来又应用于放线菌分类中。6 K) i, G7 ^' [  m. M
根据有关学者的试验表明，这种方法简便快速，样品少，结果较好，不仅可以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质，同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。但是它也有不足之处，借助于红外线光谱区分属内的种和菌株是困难的，但可以作为“属”的分类特征。" o+ _7 l* w1 b& ~
3、气相色谱GC
4、高效液相色谱HPLC
5、质谱分析MS
三、微生物鉴别方法——分子生物学方法1 i" n# w) K# H  I
1、DNA碱基比
DNA碱基比[（G+C）mol%]，以G+C物质的量分数（mol%）表示：: N- b- B" b8 y9 O( ]5 r
（G+C）mol%=（G+C）/（A+T+G+C）%
该比值的变化范围很大，原核生物变化范围是20-78%，真核生物的变化范围为30%-60%。
目前已经测定了大量生物的DNA碱基组成，从中可以发现一些带有规律性的结论：①亲缘关系密切而表型又高度相似的微生物应该具有相似的DNA碱基比；不同微生物之间的DNA碱基比差别很大，则表明它们之间亲缘关系疏远。②DNA碱基比相同或相似的微生物并不一定表明它们之间的亲缘关系就一定相近，这是因为DNA碱基比只是指DNA中4种碱基的含量，并未反映出碱基在DNA分子中的排列顺序。③一般认为，DNA碱基比相差超过5%就不可能是属于同一个种，DNA碱基比相差超过10%可考虑是不同属。2 h& B0 O7 T$ Q5 M4 L6 T
DNA碱基比可用化学方法或物理方法测定。由于化学方法比较费时，而且误差也较大，因此目前比较常用物理方法进行测定，尤其是热变性温度法。该法操作比较简便，重复性较稳定，常被作为首选而采用。该法是用紫外分光光度计测定DNA的熔解温度（Tm）。它的基本原理是：首先将DNA溶于一定离子强度的溶液中，然后加热。当温度升到一定的数值时，两条核苷酸单链之间的氢键开始逐渐被打开（DNA开始变性）分离，从而使DNA溶液365紫外吸收明显增加；当温度高达一定值时，DNA完全分离成单链，此后继续升温，DNA溶液的紫外吸收也不再增加。DNA的热变性过程（即增色效应的出现）是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度或熔解温度。在DNA分子中，GC碱基对之间有3个氢键，而AT碱基对只有2个氢键。因此，若细菌的DNA分子G+C含量高，其双链的结合就比较牢固，使其分离成单链则需较高的温度。在一定离子浓度和一定pH的盐溶液中，DNA的Tm值与DNA的G+C含量成正比。因此，只要用紫外分光光度计测出一种DNA分子的Tm值，就可以计算出该DNA的G+C含量。

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