层析技术在生物制药中的应用

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层析技术作为一项强大的纯化工具，广泛应用于多种行业。本文主要介绍了层析技术在生物制药生产中的应用情况，并对其工艺发展趋势进行了探讨。

层析技术是供制造商使用的功能最强大的纯化工具之一，广泛应用于多种行业。
就生物制药工业而言，先进的层析技术正在帮助制药厂家解决所面临的一些巨大的产能挑战。为了满足生物制药对无杂质的蛋白质、病毒、核酸、酶和酶抑制物不断增长的需求，生产厂家必须意识到需不断增加层析技术在药物纯化方面的应用。  
本文针对层析工艺最新趋势和技术进行了探讨。
定制层析目前有大量不同来源的基于重组细胞的治疗方法，包括哺乳动物和非哺乳动物细胞、转基因牛奶，以及玉米和烟草类植物。这样的多样性就要求层析工艺的个性化，以达到最高的效能。在某些情况下，药物纯化过程可能包含多达 6 个独立的层析步骤。庆幸的是，新的创新和先进的工程技术可以帮助生产厂家根据具体应用定制适合的解决方案。对重组细胞治疗性药物的生产厂家而言，柱层析是下游生产过程中最常用、也是功能最强大的纯化方法，可采用包括亲和、离子交换、疏水作用以及金属螯合和凝胶过滤等在内的多种方法。随着要求高剂量和长期监管的药物数量不断增加，要以更快的速度增加产量以满足需求，这已为厂商带来巨大压力。通过扩大柱层析设备实现产能增加，目前生产中所使用的最大层析柱直径超过 2 米，而且在某些生产设备中可能还需要更大的层析柱。  
层析柱装填的发展在过去 10 年里柱层析有了许多创新，尤其是在自动化和过程控制领域。用于流体传送和数据采集的新式精确控制器以及先进的处理系统都提高了柱层析的可靠性和重现性。 自动化促进柱层析科学发展的一个领域是装填工序。将介质装填到层析柱中曾经被认为是一项需要熟练技巧、劳动强度大的生产活动，需要大量的操作培训才能保证一致性。但是，即使是受过最佳培训的人员，人工填料都不可避免地会导致不定因素，并可能破坏批次生产的重复性。对任何管制药品的研发而言，重复性是非常关键的，而且在某些情况下，若层析柱装填没有达到标准，产品纯度和产率就会受影响。最糟的是，该批生产会遭到破坏，导致成本大幅超支和生产停工。层析柱装填的突破在于采用自动原位装填技术，在装填过程通过独立的装填工作站，重悬介质并泵入组装好的柱内。原位装填有利于介质均匀装填到柱内，带来更好的分辨率和产率。它还确保了更稳定的填充床，从而提高了批次间的一致性。  自动原位装填的另一优点是使整个过程更加符合卫生要求，因为操作员使用的是全封闭系统。所有装填和在位清洁 (CIP) 工序无需拆卸柱头，消除了生产过程中的污染风险，并且在某些情况下还可防止操作员在处理生物危险性物品时受到伤害。随着高产量的要求，重装层析柱日益频繁，给保持柱装填的一致性带来更大压力。现在，有超过 70% 的新型柱层析操作设备采用原位装填系统。
改进过程控制和监测最近用于层析柱装填的液压控制方面的创新非常利于提高生产的一致性和可靠性，特别是对流动压缩装填操作。液压线性传动装置已整合入柱系统中，以准确的控制作用于填料床压缩轴的动力。压力表监测柱中的液压值，当柱头接触到形成的柱床时就将其锁定。每次进行装填时，控制液压值，使它保持相同，有助于确保柱床密度最优化和介质性能最大化。它还提高了批次间的重复性。柱层析最重要的发展之一是采用超声波技术监测柱内填料床的密度，此项工作迄今为止多半是在猜测下完成的。尽管仍处于发展阶段，但以超声波辅助层析柱装填的应用迟早会商业化。其性能直接决定了它具有很大的潜力，可以为操作员判断层析柱的装填情况提供精确的工具。 超声波检测器对层析柱中的柱床压缩、流动组成和可溶成份的存在非常敏感。超声波可检测层析柱使用之前所记录和验证的“实时”组成数据，与来自装填工作站的动态反馈控制，能帮助确保在使用之前装填的一致性和准确性。
膜层析带来高动态产率过去几年，作为一项可供替代的技术，离子交换膜层析取得了重大进展。在许多应用中，膜层析在速度和工艺经济性方面表现出显著的优势。这项技术是采用多孔膜，并在膜表面键合活性化学基团。膜层析之所以带来高动态产率，是因为其孔结构，该结构可通过化学修饰键合带电的亲水聚合物。与常规的层析填料相比，开放的孔结构能为生物分子结合提供更多可供使用的表面积。对流孔促使物质传递快速而且有效，因为流体流动直接穿过膜孔，没有扩散流限制。膜层析已成功应用于生产规模中DNA、蛋白质和病毒的捕获和去除。抛弃型的装填好的层析膜柱，其去除杂质的速度是柱层析的 100 倍。在柱层析中可供结合的表面积大多包含于填料孔结构中，只有通过扩散力才能达到。大分子和病毒无法扩散到这些孔隙中，仅与填料外表面位点结合。与柱层析相比，无扩散流限制的膜层析在 去除DNA、病毒、质粒等方面高出10~100倍。膜层析同样可以线性放大，这是生产厂家把产品从实验室规模放大到生产规模需要考虑的关键因素。膜层析可做成抛弃型或重复使用型。小型的实验室规模的设备用于研究和方案优化。对于生产厂家而言，它们的应用非常灵活，因为能经常作为精纯步骤添加到现有的生产环节中。由于膜层析是一次性使用的，因此不存在清洁或清洁检验的问题，大大加快了生产速度并且减少了劳动力和缓冲液成本。
基因载体和病毒的处理在捕获大分子方面，膜层析比柱层析更加有效，这在需要捕获小型质粒 DNA 或病毒的大规模生产中特别有优势。在基因治疗载体的纯化方面，膜层析日益被认为是一项可行性技术。带正电荷的Q膜可有效结合大小为23kb的质粒DNA，同时膜层析的快速处理可以有效分离不稳定的大分子质粒。 Q 化学性膜已经证明每毫升体积能结合1013 腺病毒颗粒，并且研究表明，在腺病毒和慢性病毒的纯化中，其载量也类似。
DNA 和病毒的去除膜层析可有效地去除模型病毒，比如猪细小病毒、甲型肝炎病毒、鼠白血病病毒和伪狂犬病病毒，去除效率为104和107。在具有代表性的案例中，膜层析作为纯化后期精纯步骤获得了成功的实施。FDA 和 EMEA批准了采用膜层析来纯化 Aldurazyme?，这是 BioMarin Pharmaceuticals 生产的酶替代治疗药物。  当与基于膜的分子排阻超滤过程一起使用时，膜层析按 FDA 和 EMEA 规定，提供病毒去除的正交法。这使 BioMarin 免于进行 DNA 分批检测，成为蛋白质药物生产中的一个里程碑。而且，除了每批生产平均节省 2000 美金以外，BioMarin 已经大大减少了生产批次失败的可能性，从对人类健康影响的意义上来说，失败的代价极其高昂。通过广泛采用与此类似的工艺，生物制药公司在单克隆抗体类和重组蛋白药物的生产中可节省数千万美元。这是一个独特但又很有说服力的例子，说明了新的层析技术如何帮助生产厂家应对生产和监管挑战。在层析系列的其他文章中，我们将更详细的分析层析技术给市场带来的一些全新的和改良的创新。