专题 发酵液预处理和固液分离工艺

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专题 发酵液预处理和固液分离工艺

从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
一、发酵液预处理工艺
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。大多数发酵产物存在于发酵液中，但也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有，但无论产物是在胞内，还是在胞外或者是菌体本身，首先都要对发酵液进行过滤和预处理，将固、液分开，然后才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行细胞破碎、碎片的分离和提取胞内产物。
预处理的方法完全取决于可分离物质的性质，如对PH和热的稳定性、是蛋白质还是非蛋白质、分子的质量和大小等等。具体方法主要有以下几种：
1、加热法
加热法是最简单和价廉的预处理方法，即把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。加热可降低液体的黏度，根据流体力学的原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，可见降低液体黏度可有效提高过滤速率；同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。例如，链霉素发酵液，调酸至PH3.0后，加热至70℃，维持半小时，其黏度下降至原来的1/6，过滤速率可增大10～100倍。
使用加热法时必须严格控制加热温度和时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响产物后续的分离与纯化。因此，加热法的关键取决于产品的热稳定性。
2、调节悬浮液的PH值
PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，因此适当调节发酵液的PH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。对于Aa、Pro等两性物质，在等电点时，其溶解度最小，这就是等电沉淀法。例如，在味精生产中，利用等电点（PH3.22）沉淀法提取谷氨酸；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质容易与膜发生吸附，通过调整PH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
3、凝聚和絮凝
凝聚和絮凝都是悬浮液预处理的重要方法，其处理过程就是将化学药剂预先加入到悬浮液中，改变细胞、细胞碎片、菌体和Pro等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其凝结成较大的颗粒，便于提高过滤速率，而且能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。但凝聚和絮凝是两种不同方法，其具体处理过程还是有差别的，应该明确区分开来，不可混淆。
（1）凝聚
凝聚是指向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质异电离子作用下，胶体粒子的双电层电位降低，从而使胶体失去稳定性并使粒子相互凝聚成1mm左右大小的块状凝聚体的过程。
发酵液中的细胞、菌体或Pro等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，由于静电引力的作用，使溶液中带相反电荷的离子被吸附在其周围，这样在界面上就形成双电层。这种双电层的结构使胶体粒子之间不易凝聚而保持稳定的分散状态，其电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶体粒子发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol / L）称为凝聚值。根据Schuze－Hardy法则，反离子的价数越高，其凝聚值就越小，即凝聚能力越强。所以，阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子的凝聚能力依次为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
常用的凝聚剂有Al2(SO4)3•18H2O、 AlCl3•6H2O、 ZnSO4 、FeCl3 、FeSO4•7H2O、 H2SO4、HCl、 NaOH 、Na2CO3、 Al(OH)3等。
（2）絮凝
絮凝是指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm左右大小的絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。
采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗粒常常只有1mm左右，比较细小，有时还不能有效地进行分离。而采用絮凝方法则常可形成粗大的絮凝体（10mm左右），使发酵液较容易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，具有长链状结构，其链节上带有许多活性官能团，包括带电荷的阳离子或阴离子基团以及不带电荷的非离子型基团，这些基团能强烈地吸附在胶体粒子的表面，使其形成较大的絮凝团。根据其来源不同，工业上使用的絮凝剂可分为如下3类：① 有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物和聚苯乙烯类衍生物等；② 无机高分子聚合物，如聚合铝盐和聚合铁盐等；③ 天然有机高分子絮凝剂，如海藻酸钠、明胶、骨胶、壳聚糖等。
目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物，其优点是用量少（一般以mg/L计），絮凝速度快，分离效果好，应用广泛；缺点是具有一定毒性。
4、添加助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，使滤饼的可压缩性下降，过滤阻力降低。
常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒和淀粉等。其中最常用的是硅藻土，它具有极大的吸附和渗透能力，能滤除0.1～1.0μm的粒子，而且化学性能稳定，既是优良的过滤介质，同时也是优良的助滤剂。

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5、添加反应剂
在某些情况下，通过添加一些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。
加入的反应剂与某些可溶性盐类发生反应，生成不溶性沉淀，如CaSO4、 AlPO4等。生成的沉淀物能防止菌体粘结，使菌丝具有块状结构，另外沉淀物本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。若能正确选择反应剂和反应条件，则可使过滤速率提高3～10倍。
如果发酵液中含有不溶性的多糖物质，则最好先用酶将它转化为单糖，以提高过滤速率。例如，万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土作助滤剂，可使过滤速率提高5倍。
6、        其他方法
发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产品质量和得率，同时对后续的提取和精制有很大影响，因此，在预处理时，必须采用适当方法使这些杂质沉淀，在固液分离时除去，以利于后面的提取和精制过程能顺利进行。
(1) 添加草酸盐除去高价无机离子（主要是Ca2+、Mg2+和Fe2+等）
(2) 去除杂蛋白的主要方法
① 沉淀法：Pro是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等形成沉淀，在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀；② 变性法：其中最常用的是加热法，还有大幅度调节PH，加酒精、丙酮等有机溶剂或一些表面活性剂等方法；③ 吸附法：加入某些吸附剂吸附杂蛋白而将其除去。

二、固液分离工艺
固液分离是生物产品生产中经常遇到的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需要进行固液分离，其方法很多，生物工业中常规的方法有分离筛、重力沉降，浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤。
1、发酵液的粗过滤
过滤是发酵液处理中常用的单元操作，通过过滤可获得20%～30%（W/V）细胞浓度的淤浆，或40%（W/V）以上浓度的细胞固体。
（1）澄清过滤
在澄清过滤中，所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠和塑料颗粒等，填充于过滤器内部即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层。当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，所以这种方法叫澄清过滤。该法适合于固体含量少于0.1g/100mL、颗粒直径在5～100μm的悬浮液的过滤分离，如麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。
（2）滤饼过滤
     在滤饼过滤中，过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维布、金属织布、石棉板、玻璃纤维纸等。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（或称滤渣）。当滤饼达到一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，故这种方法叫做滤饼过滤或滤渣过滤。该法适合于固体含量大于0.1g/100mL的悬浮液的分离。
滤饼过滤按推动力的不同可分为4种：重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。
（3）错流过滤
在一般过滤中，滤液的流动方向与滤饼基本垂直，采用这种方法时，随着过滤过程的进行，所积累形成的滤渣阻力很大，过滤速率迅速下降。为了维持较高的过滤速率，有效的方法是设法阻止滤渣的加厚，或者当滤渣达到一定厚度时采用反洗除去滤渣。
错流过滤，又称切向流过滤或十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的滤渣移走。









2、发酵液的离心分离
    利用离心机高速旋转产生的离心力来实现分离，具有分离速度快、分离效率高，液相澄清度好等优点；缺点是设备投资高、能耗大，此外，连续排料时，固相干度不如过滤设备。

qiaokai

现在用膜过滤的多一些了

juezhuo000

膜过滤是一种简单容易控制的分离工艺，但是膜过滤也不是万能的，在产品粒径比较均一或者比较集中的一段区域膜过滤还是很好用，如果溶液成分很复杂，产品分子大小分布较广，膜过滤也不是最理想的过滤手段。

山野生物

谢谢楼主。学习了