制药微生物菌种的建立

gl19860312

发酵生产药物，需产量高的菌种，自然界中的菌种趋向于快速生长和繁殖，而发酵工业需要大量积累产物，因此菌种选育很重要。常规方法是利用天然变异，从中选择优良株系。随后物理因子（紫外线、X射线、中子、激光等）和化学因子（烷化剂、碱基类似物等）和生物因子（噬菌体、抗生素）诱变育种。20世纪80年代，以原生质体融合的杂交育种和基因工程育种，90年代以后，可以用基因组shuffling育种。
1 新药生产菌的选育
1.1 自然分离
（1）样品的采集与处理
从大陆土壤、海洋水体等环境中采集样品，表层土壤（0－10cm），海洋（0－100m）。根据分离目的和微生物的特性预处理。较高温度（40－120℃）处理几十分钟至几小时，甚至几天，可分离到不同种类的放线菌。化学试剂如SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。
（2）分离方法
选择适宜的培养基，满足微生物营养需要和pH条件，添加抑制剂，有利于富集。加入抗真菌试剂和抗细菌抗生素，可以富集放线菌。
分离方法有稀释法和滤膜法。用无菌水、生理盐水、缓冲液等稀释后，涂布平板。用0.22－0.45 μm培养，细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。放线菌可在25－30℃、32－37℃或45－50℃下培养，7－14天至1月。
（3）活性测定
非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。用HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。
1.2 自然选育
在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫自然选育或自然分离。自然选育的常用方法是单菌落分离，需要反复筛选，确定生产能力比原菌株高的菌种。基本过程如下：
菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力测定→选出优良菌株。
自然选育简单易行，可达到纯化菌种、防止退化、稳定生产水平和提高产量的目的。但效率低，增产幅度不会很大。
1.3 诱变育种
诱变育种是人为创造条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，当前菌种选育的一种主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单。但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。
（1）诱变剂
诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。物理因素包括各种射线，紫外线、快中子、X射线、R射线、激光、太空射线等。化学因素包括碱基类似物，2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等；与碱基发生反应的物质，硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥、羟胺等；DNA嵌合剂，丫啶类，溴化乙锭等。生物因素包括噬菌体、质粒等。这些因素最终使遗传物质DNA的一级结构发生变化，从而导致性状变异。
（2）诱变育种方案的设计
诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。首先制定诱变方案，进行诱变实验。选择好出发菌株（starting strain），产量较高，对诱变剂敏感。进行诱变处理，交叉使用多种诱变剂比一种效果更好，对诱变剂进行合理组合。根据致死率和诱异率，确定适宜的诱变剂量。最好是既能增加变异范围，又有大量的正向变异。其次，确定筛选目标和方案，进行筛选。除高产外，还有生长速度快，产孢子多，有效利用廉价碳源等。筛选应该施加一定的选择压力（selective pressure），如抗生素、基质浓度等，或生理作用，有针对性进行。
1.4 杂交育种
杂交育种是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株。带有定向育种的性质。
方法1：接合（conjuction）
直接混合培养两个菌种，通过接合而形成异核体（heterocaryon, 菌丝中含有遗传特性不同的细胞核），进而产生分生孢子。个别细胞核发生融合，得到杂合二倍体，极少数发生染色体交换，得到重组型二倍体，进而筛选得到高产菌株。
方法2：原生质体融合(protoplast fusion)
用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。
原生质体融合育种首先要建立细胞再生体系，这样保证了融合后的原生质的有效再生。一般要求两个亲本菌种具有明显的遗传标记，便于融合后的有效筛选。除了PEG化学促进融合外，还有电融合等其他物理方法，融合效果都很好，但需要相应的仪器。链霉菌的原生质体融合的基因组重组率高达20％。最近，基于原生质体融合的基因组shuffling是细菌单染色体细胞的有效育种方法，属于分子定向化育种范畴。
1.5 基因工程技术育种
采用基因工程技术即基因克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组基因，调控代谢过程，实现目标产物的高效表达。一般希望外源基因整合到染色体中，以便稳定遗传。在传统抗生素、氨基酸、维生素发酵的育种中具有重要意义。
1.6 基因组shuffling技术
DNA shuffling（重排，改组，重洗） 又称有性PCR(sexual PCR)，是一个反复突变和重组的循环过程，从一组相关基因的随机片段（来自不同种类生物，具有相关功能的基因），通过无引物PCR的方式重新组合，装配新功能重组（recombination）基因，生产有用或有潜力的新基因产品。这些基因，再次被酶切成片断，再一次重组成新的组合基因，此过程一再重复，一直到具有高品质的蛋白质产生。
基因组shuffling与DNA shuffling类似，操作对象为单染色体组成的基因组。原生质体融合时，基因组发生重组形成突变候选库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌株，即经济适用的菌株。以前的随机突变和选择（至少10－20轮）为工业微生物筛选了优良菌株，但对表型改进仍然困难，因为表型是由分布在基因组中的一批基因决定。基本过程如下：
（1）随机突变获得单个性状优良的菌株
（2）多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）
（3）再次重复循环融合，得到融合库F2、F3、F4
（4）筛选鉴定
基因组shuffling的关键是起始突变体的选择、遗传重组的效率、选择方法的灵敏性。已经在泰乐霉素生产菌的改造、蛋氨酸生物合成途径的进化等方面取得明显效果。
2 菌种保存
目的：保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。
保存原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。
2.1 斜面低温保存
也称定期移植保存，可用于生产菌种的短期保存。利用低温降低菌体的新陈代谢，使菌种的特性在短时间内保持不变。菌种接在适宜的平板培养基上或斜面试管中，在生长温度下，生长至旺盛期，然后置于低温冰箱内，一般4℃，湿度小于70％，进行保存，每隔一定时间移植转移一次。该方法的优点是操作方便，使用便利，缺点是保存时间短，容易发生变异。
2.2 液体石蜡密封存保藏
生长好的斜面菌种或穿刺培养物，加入灭菌的液体中性石蜡油，覆盖厚度1cm左右，封闭管口，然后置于4℃低温下保存，约1年。石蜡封存，可减少水分蒸发并隔绝了氧气，增加了保存时间。但该方法不适于能利用石蜡油的菌种。
2.3 砂土管保藏
黄砂：泥土＝3：2或1：1，灭菌并无菌检查后与孢子混合，使孢子吸附在砂土上。置于干燥管中，真空泵抽气干燥后，使砂土外形松散。置于干燥器中，冰箱低温下保存，可达一年以上。对分生孢子霉菌、放线菌和芽孢细菌，可保存5－10年。只适宜于有孢子或芽孢的菌种，不适用于只有菌丝的真菌和无芽孢的细菌和酵母保存。砂土起保存载体的作用。硅胶、滤纸、瓷珠等可用于保存。
2.4 冷冻干燥保藏
生长好的菌体与细胞保护剂（脱脂奶或血清等，见表）混合，制成菌悬液在－35℃～－45℃（酒精或干冰）下预冻15分钟至2小时，使细胞快速冻结而不受破坏，保持细胞的完整性。然后低温真空干燥。封瓶后，低温避光保存。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害，有利于菌体的复苏。冷冻干燥保存时间长，一般5～10年，多达15年。
2.5 液氮低温保藏
菌体培养物，加入细胞冷冻保护剂5～10％甘油和二甲基亚砜（DMSO）制成孢子或菌悬液，浓度一般大于108个/ml。分装于小的安瓿瓶或聚丙烯小管后，密封。先降至0℃，再以每分钟降1℃的速度，一直降至－35℃，然后放液氮罐中保存。也可直接置于液氮中速冻，然后在液氮中保存或在－80℃冰箱中保存，是目前最可靠的一种长期保存方法。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

gl19860312

菌种保存机构
中国典型培养物保藏中心
中国典型培养物保藏中心：China Center for Type Culture Collection (CCTCC)，(武汉大学保藏中心)。
中国科学院典型培养物保藏委员会
中国普通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)
中国工业微生物菌种保藏管理中心：China Center of Industrial Culture Collection（CICC）
抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：
中国医学微生物菌种保藏中心：National Center for Medical Culture Collection (Bacteria)，CMCC

国外主要保藏机构
WFCC：World federation for culture collections, http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml
ATCC: American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/
IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan
NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK

kyfsy

不错的资料