甲醇酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

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1.毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

1.1 各种母液的配制

10*YNB：（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。

500*B：（0.02%生物素 Biotin）  4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。

100*H：（0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。

10*D：（20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。

10*M：（5%Methanol  甲醇）   保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。

10*GY：（10%Glycerol  甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。

100*AA：（0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）  4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。

1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1.2 常用溶液及缓冲夜

1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：

溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)

溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制）

溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。

4℃保存。

1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：

将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。

1.2.3  Rnase-H2O：

1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。

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1.2.4  TE缓冲液：

10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L  EDTA（pH 8.0）

1.2.5  STE缓冲液：

0.1mol / L,  10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)

1.2.6  SCE缓冲液：

1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA

1.2.7  1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：

132 ml 1M  K2HPO4

868 ml 1M  KH2PO4

1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：

242 g   Tris

57.1 ml   Acetic Acid

37.2 g   EDTA

2．毕赤酵母表达的培养基配制

2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：   

Trypton        l％

Yeast Extract   0.5％

NaCl          l％

PH 7.0

制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：   

Trypton        l％

Yeast Extract   0.5％

NaCl        0.5％

PH 7.0

制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。

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2.3 YPD （又称YEPD）

Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）

Trypton               2%

dextrose (glucose)    2%

+agar                 2%

+Zeocin              100 μg/ml

液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。

2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：

yeast extract         1%

peptone               2%

dextrose (glucose)    2%

sorbitol              1 M

+agar                 2%

+ Zeocin              100 μg/ml

不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.5 MGY

Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）

（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.6 MGYH

Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）

在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。

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2.7 RD

Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）

（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）

1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；

2. 冷却后于45℃水浴；

3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml

无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。

2.8 RDH

Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）

在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。

2.9 RD及RDH平板的制备

1.将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；

2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；

3.迅速制备平板。4℃可保存数月。

2.10  RD及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）

1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；

2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；

3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。

2.11 MD与MDH

Minimal Dextrose Medium +（Histidine）  最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）

1.100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；

2.如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；

3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。

2.12  SOC培养基：

Trypton               l％

Yeast Extract         0.5％

NaCl                  0.05％

Glucose (1mol / L)     2%

121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存