如何获得误差小、重复性高的定量PCR结果？

gl19860312

qPCR方法的准确性和可重复性一直备受争议。即使同一批样品、同一个人操作，在不同的时间点，可能会获得趋势一致，但是结果不同的的qPCR data。

对于定量RT-PCR来说，获得一个误差小、重复性高的定量PCR结果，关键在于以下因素：
1,从组织和细胞获得原始材料时，细心程度和可重复程度；
2，RNA的抽提和纯化
3，RNA的反转录
4，将cDNA进行定量PCR扩增
5，操作者“双手”的灵巧程度

事实上，即使是那些非常有经验的PCR技术员，在上述操作时出现失误或者不准确时，也会获得难以反映生物学真相的数据【参考：Taylor, S., Buchanan, M., and Basik, M. (2011) A MIQE Case Study—Effect of RNA Sample Quality and Reference Gene Stability on Gene Expression Data. Bio-Rad tech note 6245.
； Lanoix, D., Lacasse, A-A, St-Pierre, J., Taylor, SC, Ethier-Chiasson, M., Lafond, J. and Vaillancourt, C. (2012)】
比如，在用qPCR分析非正常状态下（比如怀孕、疾病）胎盘里某些基因的表达稳定性，学者们采用18sRNA、GAPDH和b-actin这些为人们常用的内参基因来nomalization时，虽然能获得一些符合预期的结果，但是也有不少结果和预期设想背道而驰。实际上，我们许多lab的学生和技术员在抽提RNA只关注RNA的260/280比值，而忽视RNA的完整性。事实上，就胎盘组织而言，在样品处理过程中，大约有20%的RNA会严重降解。因此，对RNA的完整性进行测定，会提高qPCR结果的准确性和可靠性。

还有一个细节就是样品体积问题。在高通量的操作环境下，很多研究人员都是在384孔板内使用10ul的体系进行操作。在这种情况下，模板DNA添加的准确性就至关重要。在实践上，通常一个可行的办法是将cDNA稀释，然后加入整个反应体系一半体积的cDNA，这样就能有效防止加样时产生的误差。如果你的反应体系里包含了水，务必考虑将这一部分“水”包括到你的模板总体积中去。

另外，由于样品来源不同和样品处理过程中存在的不可避免的差异性，现在很多研究人员在测定同一个靶基因时，同时使用多个内参基因，然后通过一种叫geNorm的软件来分析normalization之后的结果。

内参基因的选择对于获得准确的结果也很重要。学者发现，HPRT在人类组织中表达量甚低，因此只适合在检测在人类组织中表达量比较低的组织中用作内参。此外发现，GAPDH and ACTB, genes most frequently used for normalization, were heavily regulated during HCC carcinogenesis and progression. B2M expression levels varied with hepatitis infection status. The combination of HPRT and TBP expression levels were the most stable, regardless of differences in tumor stage and cirrhotic and malignancy status.

你在qPCR操作时，有哪些宝贵的经验，从而能够让你屡屡获得为之自豪的Conclusive, Reproducible RT-qPCR Data？

gl19860312

1.做标准曲线样品稀释时用带滤芯的枪头；
2.标准曲线样品加样顺序从低浓度到高浓度依此加样。

1. 防止仪器系统误差：反应体系加入本底荧光试剂；
2.防止反应体系组份加样误差：配制Maser Mix反应体系，然后等体积分装，可-20度保存一周备用。

qzl2013

学习一下，感谢分享

hyaline

微量分注器使用前要先用微量天平校正，定量吸取體積與重量；吸取時要注意是否有達到足夠的量，吸取位置要在液面之下靠近管壁處。

306436072

根据cDNA的样品数计算反应体系中每种试剂的总用量，最好多计算一个（粘在枪头和管壁上会损失）；每个体系混匀后用移液枪轻轻均分到平行管中（可以设置五个平行，最后选取三个较好结果），避免产生气泡；加过一种试剂后将EP管盖子的方向改变。

hyaline

現在八爪有改進了喔？ 我以前都不敢用，怕不准。