RT-PCR反应过程与体系简历

gl19860312

总RNA提取


1.
取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。


2.
震荡30s。


3.
加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。


4.
12000×g，4℃ 离心，15min。


5.
吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。


6.
加等体积异丙醇，-20℃，30min。


7.
12000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀


8.
弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。


9.
7500×g，4℃ 离心，10min。


10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5－10min。


11. 沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280


12. 计算浓度与纯度，－70℃保存。

      　　　　　　　
OD260×40×稀释倍数


RNA浓度（μg/μl）＝────────────



1000

gl19860312

逆转录合成 cDNA

           反应体系如下

      ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━


MgCl2
2μl


10×RT Buffer
1μl


RNase Free dH2O

3.75μl


dNTP Mixture(各10mM)
1μl


RNase Inhibitor
0.25μl


AMV Reverse Transcriptase
0.5μl


Random 9 mers

0.5μl


Positive Control RNA (1μg)
1μl

      混匀快速离心一次

      反应条件如下

                  30℃
10min

                  42℃
30min

                  99℃
5min

                   5℃

5min

          -20℃ 冰箱冻存                        



PCR反应

      ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

      摸板cDNA
2.5μl


5×PCR Buffer
2.5μl

      灭菌蒸馏水
7.2μl

      聚合酶 Ex Taq HS
0.1μl

      上游引物
0.1μl

      下游引物
0.1μl　

      ─────────────────────────────

      　Total
12.5μl

      混匀快速离心一次

      反应条件

      94℃
2min
1Cycle

         94℃
40sec
┓


50-65℃
40sec
┃
25-35Cycles

         72℃
1min
┛

         72℃

5min
1Cycle


PCR产物-20℃冰箱保存

      取PCR产物8μl　加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V


100mA 30min
溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果