动物细胞规模化培养

lwdfjw · 发表于 2008-2-20 22:07:05

1，介绍
关于动物细胞规模化培养的介绍网上有很多，比如
http://www.istis.sh.cn/list/list.asp?id=1253
,是我们国家近年来扶持的要害技术之一。该技术主要应用于复杂、分子量巨大的蛋白表达以及用于基因治疗或疫苗的病毒生产，和其他工艺过程相比优势明显（有爱好的战友可以在网上找到很多资料），但难点也很多。说得复杂一点：学科交叉大。细胞生物学，生化工程，机电工程（这个话题比较宽泛，涉及整个制造业环境），也不多说。
具体到实验室规模主要体现在：
1），高效表达载体的构建，这个也没什么好说。
2），cell line的筛选是一个很繁重的工作（Job）（对于稳定株筛选而言）。
3），无血清悬浮培养驯化，主要也就是无血清培养基的优化也是一个工作（Job）量巨大的工程，由于商业上的原因该方面的成果基本上很少共享。目前各公司采取的策略基本上有两种：自主研发和从商业培养基提供商（比如SAFC，GBiCO)获得。但最终都会倾向于自己研发为主。
4），高密度培养和流加工艺，目前也主要有两种用于工业化生产：批次补料（fed-batch cultivation process)和灌注培养（perfusin cultivation process)。两种工艺各有优缺点，但是假如要做上上万升的规模，fed-batch cultivation process则更易于放大。
5），不管是从细胞生物学的角度还是培养工艺的角度，防止细胞过早凋亡，产率下降都是一个难题。这有赖于细胞株在分子水平上的进一步改造（比如重组入各种抗凋亡基因）和培养后期加入各种抗凋亡的营养物质。

2，进展
   随着整个产业的发展，该项技术的更新可以说是非常惊人的，20年前细胞培养的水平还在最高10^6 cells/mL上下徘徊（antibody表达量不过区区30－50mg/L),而20年后的今天，文献报道已经达到了5＊10^7 cell/mL(antibody表达量也已经达到了5g/L的水平,在未来3－5年很可能达到10－20g/L(according to materials from Amgen Inc.)）。
http://www.ibclifesciences.com/BPI/US/
从最近一期国际生物过程工艺会议上可以看见。
另外，随着人类基因组计划的完成，在后基因组时代各个研究机构、生物制药公司将要对成千上万的蛋白进行功能研究和筛选，但这么多蛋白又不可能在短时间内完全由单个独立的单位来完成，因此也孕育了一个巨大的为生物制药公司和研究单位提供这方面服务的市场。每个蛋白都需要mg-g级水平，同时又要具有与天然蛋白几乎完全一样的功能和结构，所以谁能够在短时间内具有更大的生产能力无疑就是这个市场的胜利者。在这个方面最近几年一直有更新的技术出现。

这两天电脑坏了，预备得不是很充分（有些是凭自己的理解写上来了），有不足的和错误的地方，请大家多多批评。
这个话题保持时常更新(主要集中在动物细胞规模化培养但不限于），希望有更多的朋友参予进来，也为我们国家这个行业的后进做一丁点努力。
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http://www.accelacast.com/programs/ibc_technologies/

Bioprocess international conference%26exhibition , 2005 的演讲资料。
1，H. Michael Koplove, Ph.D., Vice President, Wyeth BioPharma/Vaccine Technology and Engineering
Bulding, buying, remodeling, and selling biopharmceutical plants

2, Duncan Low, Ph.D., Amgen Inc., Process Development, Scientific Director
Current practices and future  directions in bioprocess
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               Why mammalian cells?
"Some advantages of the use of mammalian cells as hosts for the production of heterologous proteins are:
（a） proteins are readily synthesized and secreted directly into medium, which makes purification and recovery simple and straightforward;
（b） proteins are folded, and disulphide bond formation is established efficiently. These processes take place in a manner very much like that of natural proteins. Both N-linked and O-linked glycosylation occur at normal positions, and other post-translation modifications, such as gamma-carboxylation, beta-hydroxylation, tyrosine sulphation, phosphorylation, and glycosylation are performed in mammalian cells. Moreover, multimeric proteins can be correctly assembled."
...
Annals of Hematology1994;68 Suppl 3:S9-14
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               国内在这个方面做得还远远不够，生物反应器的设计由于未把握核心技术远远达不到国外的水平，世界上作反应器比较好的是美国NBS，瑞士BIOENGEERING。在一个哺乳动物细胞的放大是一个很要害的问题，国外在上个世纪80年代其规模就达到5000l，目前，更是上万升。我国的加油了！
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               wdh5396 wrote:
国内在这个方面做得还远远不够，生物反应器的设计由于未把握核心技术远远达不到国外的水平，世界上作反应器比较好的是美国NBS，瑞士BIOENGEERING。在一个哺乳动物细胞的放大是一个很要害的问题，国外在上个世纪80年代其规模就达到5000l，目前，更是上万升。我国的加油了！

诚然。
但是需求也决定了供给，我们国家现在落后的主要是培养工艺，设备倒在其次。没有上规模的工艺，也就决定了没有相应规模的设备的提供商。从国外生物制药的发展历史来看，基本上都是制药公司的研发在推着设备制造商往前走。仔细看一下前面帖子Wyeth 的VP所做演讲就知道了。

我们的目的，不仅仅限于只是责备国内的制造商，其实更大程度来自于对行业自身的催促，因为这里才是根本。

这几天有点私事，没有更多的总结和介绍相关的情况，最迟这周末会多少有所弥补。

同时想说，我想把这个帖子做得像样一点。在讨论的同时也就是整理和探索的过程，把它真正当成一件事情来做。

谢谢参予！
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               目前，从世界范围来看，由动物细胞生产生物医药占到了80%，世界各大医药巨头都将大规模细胞悬浮培养作为一个必备的技术平台竞相发展，再看看我国的医药界，大多数的产品还是局限于大肠杆菌等原核表达产物，即使在人药产品，要害的技术设备及生产工艺还得依靠于进口，有的企业引进了先进的设备也是放着，本身就没有把握要害的培养工艺及培养放大原理，有很多的细节没有搞明白；我本身是作兽用疫苗，这块就更差了，还是老一套的细胞培养方式，这其中有很多制约因素，其中的设备是其一，培养放大工艺也是一道难关。我想，老外能在短短的几年内能突破技术难关取得那么多成果，我们为什么不能，想在这个领域赶上发达国家，需要整个相关行业的协同发展。
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               这个话题很好，希望相关行业的人都来说说，学习学习。
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               CCCDNA总结了好多啊，崇拜中！学习中！
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               Some cases for large scale vaccine production

细胞培养制备流感疫苗主要使用Vero、MDCK、PER.C6三个细胞系
一般而言，Vero细胞系产量小，副作用低些，MDCK细胞系产量高，副作用大些。
Solvay、GSK及凯龙都选择了MDCK细胞系，其中Solvay使用MDCK生产的流感疫苗已经在荷兰上市，商品名为Influvac  TC，
凯龙的流感疫苗在欧洲已经进入了Ⅲ期临床研究。
而使用Vero细胞培养的流感疫苗碰到困难，Baxter公司的流感疫苗在进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究时发现发热过高，
已经于2004年暂停，在调整配方后，预计在本年底重新启动。
巴斯德与Crucell公司合作开发的基于PER.C6系平台的流感疫苗也将于今年底进入临床研究
from
http://www.biotech.org.cn/news/news/show.php?id=37481

Next post about transient expression in large scale will soon be presented...
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               transient expression in large scale
如主贴所言，各制药公司为了在短时间内获得数种mg－g级的蛋白进行功能研究或者药物筛选（以满足大型动物实验、下游工艺的初步开发、稳定性测试等等），而利润点的趋同也使得竞争尤为残酷－－输掉的一方将失去之前投资的几乎所有研发成本，因此时间也就成为了竞争中最重要的一环。用常规的方法，即获得稳定的表达株，根据文献我们知道，从上游构建开始到最终结束，耗时基本上在4－6个月左右或更长，在这种情况下大规模的瞬时表达开始成为研究的热点。
transient expression对于大多数做基础研究的人来说并不生疏。
对于转染方法而言主要有如下几种选择。
1) 脂质体传染: 我们知道用脂质体传染做大规模的生产几乎是不可能的。原因在于脂质体非常昂贵和大剂量下的细胞毒性。
2) 磷酸钙法传染:是一个比较传统和便宜的方法，在优化好各种参数后也可以得到相当高的转染效率。但它唯一也是致命的缺陷在于其过于复杂的转染步骤（过多的离心和换液）可能引入污染和需要更多的设备投入（大规模的情况下，工艺的简单变更也会引起成本的数倍增加）。目前可以查到的文献，利用改良的磷酸钙法传染和瞬时表达，最大的规模是100L(引入了抗生素）。
3）PEI及类似物传染: PEI是一种很廉价的化工原料，主要用于造纸、水处理等行业，1995年（或更早)Otmane  Boussif等发现它具有传递DNA的功能同时具有相对很低的细胞毒性，并将这一发现发表在PNAS上。这一发现马上引起了从事gene therapy 的同行注重，PEI也成了nonviral gene delivery systems中十分重要的一员。紧接着几年，PEI也进入了转染试剂的行列，一个新的公司：Polyplus-transfection Inc.应运而生，同时Roche 在05年底（或06年初）推出了基于PEI转染的 FuGENE HD。基于PEI的转染实验有着其他转染方法不可比拟的优势：在保持高的转染效率的同时很小的细胞毒性，转染完毕不需要更换培养基（这一点非常适合大规模的悬浮细胞的转染），化学修饰或和其他试剂共同作用后对血清极大降低了敏感性（作为通用转染试剂必备条件）。

目前所见报道的的瞬时转染的最高产量约在200mg/L左右（表达蛋白为抗体，含FBS或类似物），而在无血清情况下要低2－4倍（50－100mg/L)，普通的非抗体蛋白表达量又要比抗体蛋白低5－10倍（5－20mg/L).

to be continued...
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               感谢cccDNA的共享.都是些经验之谈啊!很有收获.
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               学习中.....
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               楼主是做大规模动物细胞培养的吧？能不能说说咱国内的水平，国内在这方面有没有什么突破点，还有出路没有？
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               fullpower wrote:
楼主是做大规模动物细胞培养的吧？能不能说说咱国内的水平，国内在这方面有没有什么突破点，还有出路没有？

国内现阶段差距还是比较明显的，个别的公司工艺做得还不错但是远远谈不上规模（上1000升）。具体到公司有百泰，中信国健等，可以从863的项目申请情况看到。主要原因在于国内以前对工艺方面不怎么重视，起步比别人晚了很多，上游研发对下游带动不够（基本上是亦步亦趋的跟随国外，下游的发展没有内在的需求），整个投资和工业环境也不可能短时间内发生变化。
要改变这个状况还需要一个长时间的积累过程，会比较艰难。
当然国内和国外比的优势也是有的，主要在于人力便宜，经过一段时间培训是可以从事这方面工作（Job）的。很多西方国家的制药公司的部分前期研发开始在国内寻找更便宜的平台，这个市场会慢慢培育起来，这无疑会有相应的技术转移和国内自身研发的升温。这个过程会的长短取决于国内的整个行业环境是否更进一步完善....
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               也属于此行中人，说几句，这几年国内总的来说，发展得非常快，估计在3、5年后会有更大发展，到时候大学里学生物工程等相关专业的师弟、师妹们应更轻易谋到一份工作（Job）。
动物细胞培养技术涉及到许多方面：
1。细胞株构建的基因工程技术：高效表达载体的构建、宿主细胞株的改造工程等。
2。工艺优化和放大技研究：比如fed－batch、perfusion等培养工艺的开发、在线检测技术的建立、无血清培养基成份优化以及流加策略的开发等等。
3。生物反应器为基础的工业化生产设备体系的开发，以及相关在线消毒、在线清洗等设备的开发。
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               研发服务，产业分化的机遇

http://www.chinamtcm.com/html/37669.htm

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               不知楼主有专贴在此，把我在免疫技术的贴转来。有些数据可能旧了些。望抛砖引玉，得到大家的帮助。

由于人源化单抗制备技术或单抗人源化技术的进步，治疗性单抗已经成为现代生物制药产业的拳头产品。其中很多产品的年需求量都在十公斤或百公斤以上。如何提高生产能力来满足如此巨大的需求，成了各生物技术公司技术瓶颈和难题。从目前来看，能达到公斤量级以上产能的生物反应器，主要是搅拌式反应罐，容量达到一万升以上。细胞密度最高达到每毫升107，抗体浓度最高达到每升培养物一克的水平。如此规模的生物反应器目前全世界也只有几家制药巨头有能力制造和运行。但目前杂交瘤体外培养细胞密度最高，培养物中抗体浓度最高的，并不是搅拌式反应罐，而是中空纤维生物反应器，分别可达到每毫升108细胞，每升培养物5克抗体。从运行原理来说，中空纤维生物反应器是最接近动物组织结构的系统。可惜目前商品化的中空纤维生物反应器系统，还停留在克级水平。不知道是什么原因限制了这类反应器的扩展。很期待各位网友或专家指点迷津。或许在突破了这些限制因素后，中空纤维生物反应器系统能够成为另一种公斤量级的生物反应器。
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               About hollow fiber bioreactor

中空纤维反应器（也是perfusion工艺的一种，在生产小剂量如EPO的过程中有被采用---Amgen）得不到大规模推广（Promotion）的原因可能主要在于：
1，目前已有的系统（搅拌式）在各大公司已经存在和运行很多年了，工艺相对成熟，与普通摇床培养模式更兼容，也就是更易于scale down
2，相对于普通搅拌式反应器，中空纤维反应器的购置成本、维护成本（清洗、寿命、维修等等）和运行成本（一旦发生故障，比如污染将是灾难性的）明显太高。虽然在在小规模生产的条件下（比如实验室），中空纤维反应器具有一定优势，但这种模式的复杂程度决定了它在目前比较流行的大剂量药物--单抗生产的放大成本可能是普通搅拌式反应器成本的数倍至数十倍。
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               谢谢cccDNA的讨论分析：
图示的可能不是典型的中空纤维生物反应器，像似带截流装置的连续灌流生物反应器，其中的中空纤维仅仅是用作气体交换。目前商品化实验室用的中空纤维生物反应器系统，主要由一个类似人工肾血液透析器的中空纤维器（Cartridge)，蠕动泵，透气硅胶管和培养基罐组成。对制备克级单抗非常实用。成本可控制到在一毫克一美元以下，主要取决于细胞株分泌抗体的能力。建立好的系统可持续维持数月到半年，最长有一年的报道。我的问题是类似这样的中空纤维生物反应器系统为什么不可以放大？是什么因素限制了放大？生产表面积10-20平方米的中空纤维管很轻易，也不贵。完全可以一次性使用。




Doc1.doc
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                                                                                             ================================================================================
               把图片直接贴出来



screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=399 height=370 title="Click to view full clip_image002.jpg (399 X 370)" border=0 align=absmiddle>

                                                                                                                                    ================================================================================
               ningbo57 wrote:
谢谢cccDNA的讨论分析：
图示的可能不是典型的中空纤维生物反应器，像似带截流装置的连续灌流生物反应器，其中的中空纤维仅仅是用作气体交换。目前商品化实验室用的中空纤维生物反应器系统，主要由一个类似人工肾血液透析器的中空纤维器（Cartridge)，蠕动泵，透气硅胶管和培养基罐组成。对制备克级单抗非常实用。成本可控制到在一毫克一美元以下，主要取决于细胞株分泌抗体的能力。建立好的系统可持续维持数月到半年，最长有一年的报道。我的问题是类似这样的中空纤维生物反应器系统为什么不可以放大？是什么因素限制了放大？生产表面积10-20平方米的中空纤维管很轻易，也不贵。完全可以一次性使用。

在网上找了很多没有发现符合要求的图片，好轻易找到一张也没注重就贴上来了（和其原文描述的不一致），一看还真如你所说，确实不是现在主流的中空纤维反应器。现将就原图修改如下，原图的微孔滤膜并不存在（如存在便和搅拌反应器的perfusion工艺更接近了）。
原因前面已经说了，工程造价和实验室是两回事。



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                                                                                                                                    ================================================================================
               高效表达载体与宿主细胞的关系密切，虽然楼主认为没有什么好说的，但是本人还是唠叨两句，主要是针对抗体生产的高效表达载体构建。
目的基因的表达设计到的过程包括：目的基因在宿主细胞基因组的定位；目的基因mRNA 的转录；目的基因的翻译；翻译后的加工，组装；抗体的分泌。
这些步骤在载体的设计中都要有所体现：
1．目的基因在宿主细胞基因组的定位：目的蛋白基因整合的位点与其产量之间显然有密切的关系，为了整合到所谓的热点，可以采用类似Invitrogen Flp-in 系统，先筛选基因组的热点，然后，利用Flp重组，是目的基因有目的的整合到基因组的热点。

2．目的基因mRNA 的转录：强的启动子如CMV，ubiquitin C (UbC)。目的基因可以是cDNA，以可以带有一部分内含子，其实很多比表达载体都会带有内含子。其他的元件包括Kozak序列（GCCGCCACC ATG G）可能会提高转录的起始。

3．翻译：可以在目的基因的5’或3’加增强子，常用的包括Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE), cHS4 insulator elements，the translational enhancer element SP163，这些增强子可能增加翻译，如SP163就是一个内部核糖体进入位点（IRES）,不过这些enhancer 是否有效，可能只有用了以后才能有结论。此外调整目的基因的编码，剔除少见tRNA编码会增加得到高表达克隆的机会。

4．翻译后的加工，组装：一般来说，哺乳动物细胞具有较可靠的分子伴侣和糖基化相关的酶。对于翻译后事情，可能不是高效表达载体构建的事情，而是对细胞系的改造，如提高或降低糖基化程度。

此外，可扩增标记基因二氢叶酸还原酶（DHFR）或者谷氨酰胺合成酶（GS）的使用可以大大增加产量。

这里举个例子，利用可扩增标记基因谷氨酰胺合成酶（GS）作为标记基因，扩增目的基因在宿主细胞基因组中的拷贝数，达到增大产量的目的。

来源于Lonza （www.lonza.com）的一个专利里的抗体表达载体。GS在弱化启动子SV40的下游，GS与CMV之间是SV40 内含子和polyA，有利于防止串连引起的启动子阻滞。CMV下游是目的抗体的VL的信号肽，这里是有内含子的，而且还挺长；VL后面是CL;CL与VH之间用一段linker, linker的两端为Furin酶切位点，据说可以在胞内被Furin识别和酶切；VH的后面分别是铰链Hi, CH1,CH2和CH3。这样轻重链连在一起表达，有利于保持轻重链表达数量的相同，从而有利于完整抗体的产生，避免单独的轻链造成的麻烦。

好了，就到这了，不管怎样，对于单抗的生产，20年来在生产工艺上的改进使单抗的产量提高了100倍，载体构建上可做的可能已经不多了。



screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=366 height=341 title="Click to view full antibody.jpg (366 X 341)" border=0 align=absmiddle>

                                                                                                                                    ================================================================================
               既然说的是规模化培养，我想应该都会使用到发酵罐之类的培养容器吧，那么请大家能否说说自己所使用的是多大的发酵罐，都是那个公司的，发酵过程中所使用的发酵方式是什么？用起来的感觉？
我现在使用的是贝朗公司的5L的发酵罐，采用的是最简单的批式发酵。整个过程使用起来还是比较稳定的。
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               B.Braun 2L×4,10L×4.not sip and cip.
Fed-batch process.
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               Novelgene wrote:
高效表达载体与宿主细胞的关系密切，虽然楼主认为没有什么好说的，但是本人还是唠叨两句，主要是针对抗体生产的高效表达载体构建。

说得很好，我说没什么好说的主要原因在于，我的专长不在这方面，而且很大程度上，国内在这个领域的木桶短板，工艺方居首。
顺便也在这里总结一下规模化培养动物细胞的几个前提：
1）高效表达载体；
2）适合培养、高表达并相对稳定的细胞株；
3）优化的培养工艺（包括培养基、补料策略）；
4）与之工艺相应的设备。
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               我们公司的设备就是瑞士BIO的
1000L发酵罐
德国的罐是最好的
不是美国NBS
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               Cell lines in production of antibody

  据文献报道2005年通过美国FDA认证的18种治疗抗体中，有10种由CHO细胞生产，8种为鼠淋巴细胞（包括NSO和Sp2/0-Ag）生产。除此外，工业上杂交瘤细胞和人肿瘤细胞PER.C6也经常用来生产抗体。

1，一般生产抗体的CHO细胞不外乎基于两种系统：DHFR和GS系统。前者用到CHO细胞最普遍的是CHO DUKX-B11和DG44两种，后者基本上是CHO-K1或者CHOK1SV。两个系统各有优缺点：DHFR系统稳定株筛选的过程十分漫长，工作（Job）量巨大但能够筛选到Qp(单位细胞生产力）很高的稳定株（50～90pg/cell/day），GS系统由于不需要在培养基中加谷胺酰胺所以游离氨副产物很低，这一点对产物的正确糖基化和细胞生长都十分有利，而且筛选时间要比DHFR系统短一倍，但所能筛选到稳定株的基因拷贝数却可能比DHFR系统的低（4～10之间）。研究发现，当目的蛋白的天然糖基化模式和CHO细胞相同时，CHO翻译后修饰的效率很高;另外还发现，虽然动物细胞唾液酸结构和人有区别，鼠源细胞中N-glyculyl-neuraminic acid(NGNA)占绝大多数，但CHO表达的糖蛋白却有85％以上的为N-acetyl-neuraminic acid(NANA),和人体中的存在形式基本相同（NANA）。鼠源细胞的α1，3半乳糖苷转移酶会产生具有高免疫原性的Galα1,3-Galβ1,4-GlcNac,但非常幸运的是，这种酶在CHO（也包括BHK细胞）中几乎没有活性。当然CHO细胞和人源细胞表达的蛋白还有一些不同的地方，但是目前为止并没有发现这些不同会带来免疫原性问题。

to be continued...
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               和主流的观点相反，我个人认为中国在上游构建和细胞筛选上的水平很低，而这方面的提高更慢，相比之下，取得工艺上的进步更轻易一些。
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               xuxuepeng925 wrote:
和主流的观点相反，我个人认为中国在上游构建和细胞筛选上的水平很低，而这方面的提高更慢，相比之下，取得工艺上的进步更轻易一些。

我可能不同意你的观点,据我所知，动物细胞表达载体构建在国内并不新鲜了，具体的个案不在此列举，但你在CNKI上看看应该有所了解－－当然我这么说也并非说这方面已无改进可言。细胞筛选，相对来说主要体现在工作（Job）量上，即使是国外除了用机器人代替人工筛选外据我所知目前也并没有实质上有突破的办法（国内国外关于基因特异性的整合进染色体而获得高表达的案例都仅仅限于研究，是否具有商业价值还要进一步研究,至少目前在商业化生产中还没见到－－关于这方面的综述已经有了，并不象人们一开始想象的那么简单）。工艺的进步相对来说是一个更加系统的问题，而很多人在这方面过多的借鉴微生物培养的经验，实际上动物细胞（抑或昆虫细胞）的大规模培养要比微生物苛刻得多。某种意义上说，它不单单需要细胞生物学方面的支持，更需要有很强的工程方面的概念（这个恰恰是很多半道从生物学方面转过来的所极其缺乏的，也因此导致得出很多错误的概念－－这样的例子非常多）。工艺的意义也就在于需要整合各个单个的方面的进步，最终转化成生产力，而这个就目前国内的状况来说，从事的人不多，而能胜任的就更少之又少了。
                                    ================================================================================
               工艺上面较之于上游构建发展更困难，以个人观点还在于：
1）工艺研究方面的资料大多数存在于各个商业公司，只要不是公认成为成熟技术前，基本上不会发表。这一点和上游构建有很大差异，后者可以借鉴的的东西要多得多。
2）比较费钱，这是国内发展之所以慢的又一个原因。反应器的设计制造牵涉的基础产业要比上游构建多，而我们国家这样生物行业的基础部件制造商少且质量上不去（虽然技术上也许并没有克服不了的困难）。反过来说，这个行业也没有表现出来这方面的旺盛的需求。
3）基于2），人才培养跟不上，高校学生或研究生基本上得不到这样的实践机会，即使有人想做这方面的事情，也不一定马上能有这方面的合适人才，随之而来的培训将又是一笔成本。

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动物细胞规模化培养

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