发酵过程中pH值调控方法浅析

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微生物发酵是一个十分复杂的生物化学反应过程，由于生物体的生长、繁殖、代谢有许多不确定性，并受环境影响比较大，而微生物细胞内同时进行着成千上万种不同的生化反应，各有各的调控机制，相互促进相互制约，因此，其控制过程也比较难，只能依据宏观现象或借助一些检测手段来推测微观变化，而后施行进行人为干预，进而引导其朝着我们设定的方向发展。


通过取样分析获得与微生物发酵相关的参数包括：物理、化学、生物三类。（宏观现象不在本文赘述）。



1、物理参数包括：温度、罐压、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、发酵液粘度；

2、化学参数包括：酸碱度、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、中间体物质浓度、产物浓度、比生产速率、尾气氧含量、尾气二氧化碳含量；

3、生物参数包括：菌体浓度、比生长速率、菌体形态；



各参数调控方式以及各参数之间错综复杂相互关系，今天不做展开，仅对pH值的进行详细分解。



第一部分 现行的pH控制理论



第一节 为什么要控制pH值？



1. 影响菌体生长：

每种微生物都有其适合生长的pH值范围，原因有二：

（1） 对营养成分的影响：不同的pH值条件下，培养基中各营养物质的稳定性不同；各营养物质之间发生化学反应不同；有机碳、氮源的水解或变性情况不同。进而影响菌体对营养物质的利用。

（2） 对菌体生物酶活性影响： 培养基中的H+或OH-直接影响胞外生物酶的活性，进而影响菌体生长。

（3） 对菌体细胞结构的影响。

（4） 对菌体细胞膜荷电影响：引起细胞膜的通透性发生改变，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢物排泄。



2. 影响菌体代谢：

培养基中的H+、OH-首先作用在胞外的弱酸（或弱碱）上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸（弱碱），它们进入细胞后，再进行解离，产生H+或OH-离子，改变胞内原先的中性状态，影响酶的结构和活性。进而影响菌体代谢。



3. 影响产物稳定性：

不同的物质有不同的稳定pH值范围。特别是胞外表达的产物，直接裸露于培养液中，给予合适的pH条件至关重要。



4. 影响发酵液的后处理：

（1） pH值直接影响发酵液中某些物质的电荷性质

（2） pH值会影响发酵液的粘度。



第二节 是什么原因使pH值产生变化？



1. 培养基基质：

（1） 成分种类、含量及配比，分两种情况：

其一，成分本身的酸碱特性；

其二，成分经过菌体代谢后呈现出酸碱性：凡是代谢后产生酸性的物质，称为生理酸性物质；经代谢后产生碱性的物质，称为生理碱性物质。

生理酸性物质，如硫酸铵：菌体吸收其中的NH4作为氮源，残留的SO4与培养液中的H+结合成硫酸而使pH值降低。

生理碱性物质，如硝酸钠：菌体吸收其中的NO3-量远大于对Na 的吸收量，为保持体内电性平衡，细胞向外界分泌HCO3-或OH-，使溶液的pH值上升。

（2） 培养基灭菌：培养基中基质成分在高温高压状态下发生变化引起pH改变。



2、 菌体生长不同阶段对pH影响不同：

（1） 菌体指数生长期：本阶段pH值迅速降低。

原因如下：

为满足菌体快速生长，大量营养物质被利用，打破原有体系的pH值体系平衡。

如：碳源代谢：无论是单糖、双糖、寡糖还是多糖，均先经水解为单糖再被利用，利用后产生有机酸，使pH值降低。




图：糖代谢途径（点击图片放大查看）





（1） 菌体生长平台期：菌体生长、衰亡趋于平衡。pH值基本呈下降，但趋势趋缓。若此时pH快速回升，说明碳源被利用完，菌体被迫利用胞内有机酸所致。

（2） 菌体衰亡期：由于菌体衰亡、自溶，pH值迅速回升。



注：若在菌体平台期、衰亡期出现pH值迅速下降状况，原因可能如下：

1） 传感器故障；

2） 染菌；

3） 补料时间过早，前期营养物质剩余；

4） 补料速率不合理，造成二次生长。



3、通气量及罐压

（1）通气量不足：

1）引起pH降低：厌氧发酵，产生大量乳酸pH值降低；另外，通气量流量小，产生的CO2不能及时随尾气排出，CO2溶于水中，使pH值降低；

2）引起pH值升高：氧气供应不足使菌体衰亡自溶，引起pH值升高。



（2）罐压太高：一般高于0.03Mpa

引起pH值降低：随着压力增高，CO2在水中溶解度增加，因此引起pH值降低。



第一节 发酵过程中pH值控制手段



1、 改变培养基中基质成分及比例：

每种微生物生长，以及目的产物的合成对营养物质的需求有一定的偏好性，因此可以利用来调控的空间不大。



2、 培养基中增加缓冲体系：

但需关注缓冲体系成分对菌体生长代谢的影响。



3、 培养过程中通过补加碳源来调节pH值



4、培养过程中使用酸、碱进行调控：

常用酸如：盐酸、硫酸、醋酸、硝酸等；常用碱如：氢氧化钠、氨水等。



注意：

（1）氨水可被作为氮源利用，因而打破营养物质的碳氮比平衡。

（2）酸、碱调解过程，会造成培养液的局部过酸或过碱，从而引起局部菌体被灼伤、或代谢物被强酸、强碱破坏。

（3）酸、碱调控，会改变培养液的离子强度。



第二部分 本人经验分享



第一节 发酵过程中pH值变化的本质



1、 pH变化的关键原因：除培养基基质成分、通气量和压力等理、化因素影响外，更多的是菌体生长代谢过程的生物因素。



2、 pH值检测方法：在线的pH电极即时测定；取样离线的pH计、pH试纸测定等。



3、 pH值变化的本质：

由pH值测定方法可以看出，无论何种方法的测定值均代表的是菌体生物过程的结果，也就是说pH值测定永远滞后于菌体的生物过程。因此，pH值是菌体生物过程的结果。



第二节 基于pH值是生物过程的结果理论而形成的发酵过程中pH值控制原则和方法



既然pH值是生物过程的结果，那么一个发酵周期内菌体能够自然的达到理想的菌体生

长代谢所需的pH值才是“本”；而基于即时测定值而此进行的任何调控均是事后之事，谓之为“末”并不为过。常规的pH调控手段，往往掩盖了菌体生长、代谢的真实状态。因而为了控制pH值而控制pH即为“舍本逐末”。



1、pH值的调控原则：

（1）以前馈作为调控节点；

（2）以顺势引导菌体生产、代谢过程为调控依据；

（3）以测定的pH值作为对调控手段有效性的检验。



2、pH值的调控方法：把握前馈节点，控制菌体生长速度的方式，使发酵过程pH值在理想范围内。

（1）基础培养基配方：尽量避免缓冲体系；低浓度的碳、氮源，一般含量不超过1%；避免碳、氮源比例失衡（不同种类微生物、不同的代谢产物 所需碳氮比不同）；

（2）补料培养基配方及补料速率：分三个阶段



第一阶段：指数生长期。

1） 补料配方：碳氮比宜高，且以速效碳、氮源为主；

2） 补料速率：控制比生长速率在30%左右，即可控制pH平缓下降。

生长速率太低生物量积累太少不利于产物表达。生长速率过高，菌体迅速进入衰亡期，pH值变化幅度过大、生产周期短，进而不利于产物积累。

3） 补料节点：以pH值比变化速率降低为补料节点（前馈点），可以有效的控制pH值变化，且不会造成营养过剩、或营养匮乏。



第二阶段：平台期（初级代谢产物开始积累）。

1） 补料配方：碳氮比缩小，增加迟效碳、氮源。

2） 补料速率：控制生物量基本保持不变，即可控制pH平稳。

3） 补料节点：以pH值比变化速率降低为补料节点（前馈点）。



第三阶段：衰亡期（次级代谢产物大量积累）

1） 补料配方：碳、氮源浓度仅维持菌体代谢即可。

若过高则造成菌体二次生长，使pH值下降。

2） 补料节点：以pH值比变化速率降低（缓慢回升过程）为补料节点，可维持pH值平稳。



总结：

发酵过程中的pH值变化是发酵过程状态体现、是生物生长代谢的结果。pH值不是发酵过程中需要控制的参数，而是发酵过程控制的依据和方向标。

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第二部分可以思考