生物传感器在发酵调控中的应用

金玉良缘

生物传感器在发酵调控中的应用

本文以华东理工大学发表的《A simple novel approach for real-time monitoring of sodium gluconate production by on-line physiological parameters in batch fermentation by Aspergillus niger》和《金霉素发酵过程的代谢特性及调控策略》为基础，向发酵工程师普及生物传感器在发酵调控中的应用相关技术和知识以及多尺度发酵调控的基础知识和思路。     
实时监控（Real-time Monitor RTM），一般是指利用在线或离线传感器或检测仪对系统运行的过程进行同步的检测，并将检测的结果输出到计算机及显示器的过程。       
由于发酵系统是一个多尺度，多参数的复杂系统，因此仅靠手工检测无法实现系统的稳定控制，所以经常影响工艺水平也制约着管理水平的提高, 导致生产不稳定, 发酵系数低, 能耗大, 成本高等问题。
由于发酵过程酶学研究的困难 , 以及过程数据采集和处理的困难 , 发酵工艺优化研究的基本思路仍旧是寻找最佳培养基配方和最佳的操作条件 , 其本质是以细胞代谢流为控制要点 , 使物质代谢最大程度地流向目的产物形成的代谢途径 。    
如果能够采用计算机控制技术, 对发酵过程进行实时监测与自动控制、管理和优化操作, 不但能解决上述存在的问题, 而且可以提高自动化水平, 减轻操作人员的劳动强度, 提高发酵系数和经济效益。因此, 研究和开发生物传感器及计算机控制方法，对发酵过程中的良好控制具有很大的现实意义。
论文中发酵罐信息

图1.论文整体检测参数和设计方法
本文采用了多参数在线检测技术，通过比较3个发酵批次的参数变化，构建代谢网络观察代谢流变化，从而证明：提高GOD, LAC 和 CAT 3个关键酶活，可以显著提高发酵单位。论文中的3个批次之不同来源于：F1为初始条件的批次，F2为调节搅拌速度控制溶氧的批次和F3调节培养基水平，并控制溶解氧的罐批。F3的发酵单位比F1提高1倍。


本文过程检测参数如下（Fig.1 ）：pH，搅拌转速，温度，DO，尾气中氧含量，二氧化碳含量，发酵液重量，从而可计算出发酵过程的OUR，CER，RQ和Kla。
离线检测参数包括：菌体，葡萄糖浓度，葡萄糖酸钠浓度，菌休干重及发酵液粘度，及柠檬酸浓度。      
      
对于三批发酵，摄氧率(OUR)在不同策略之间有显著的差异,二氧化碳释放率(CER)和呼吸商(RQ)。


从葡萄糖酸钠的发酵过程的葡萄糖的代谢曲线可以看出，曲线呈阶段性的下降趋势




金霉素发酵50h前 , 总糖含量维持在较高的水平 , 从起始的 6 . 67 % 逐渐下降到 3 . 6 %。 由于菌体生长和产物形成都需要大量的碳源 , 保持较高的糖含量很有必要 。随后菌体代
谢减弱,糖耗明显降低,总糖维持在2 . 5 %～ 3 . 5 % 左右。还原糖在开始十几小时较低,随后逐渐上升,到18h 达 1 . 46 %, 然后再慢慢下降,基本在1 . 25 %～1 . 50 %之间。这是因为发酵开始一段时间，菌体对还原糖的利用速率大于淀粉的水解速率 , 随着菌体的生长,淀粉酶受到诱导作用后,淀粉水解速率增大,使还原糖浓度升高。细胞生长进入指数生长期,菌体的比生长速率μ达到最大值, 糖耗增大,应开始补料 。在发酵后期,糖含量的偏高或偏低是由于补料速率过高或较低所致 。由此可见补料过程对发酵效价可产生重大影响，因此使用葡萄糖生物传感器分析仪可以快速实时检测葡萄糖浓度，从而更好的控制发酵效价。
近年的研究发现 , 在生物系统中存在混沌现象 , 发酵初期的微小变化可能使发酵过程呈现出多态性和不稳定性。 所以 , 通过控制前期适宜的菌体生长速率( 即比生长速率 μ = 1/X· dX / dt) 对整个发酵过程是至关重要的。若μ太小 , 将会使菌体生长缓慢 , 对数生长
期过长,菌体不能良好生长,酶活力不强 , 产物产率低 ;若μ太大 , 菌体生长过快 , 使代谢过于激烈 , 在中前期使氧耗过大以及因菌浓很高使发酵液粘稠导致氧传递能力下降 , 易产生溶氧降至临界氧浓度以下,影响菌体的正常代谢和产物形成 , 同时 , 菌体活力过早减弱 , 也使金霉素效价偏低。因此,优化培养基的成分,控制补料速率及其它有关工艺参数 , 是 CT C 发酵过程的一个关键因素 。μ ( 1 / h ) 的计算可以 μ = 1/X( Δ X/ Δ t) 近似估算 , X 为菌体浓度 , 由相对菌体浓度减去消后菌浓( 固含物含量 ) 得到 , Δ X 为菌 体浓度的增加 , Δt为时间间隔 。
代谢网络构建及代谢流分析
       
通过代谢流分析，可以显著发现葡萄糖流向产物的比例从F1的84.6%，提高到96.5。

上图为试验过程中3批葡萄糖过程检测结果，通过比较代谢流数据与葡萄糖的浓度变化，可以得出以下结论：F3与F1相比，糖的代谢加速，而且转化成产物的比例提高。如果没有代谢流分析，则我们只能得出只有提高糖消耗率就可以提高发酵单位。但是得不到具体的措施：如何提高糖的消耗率，以及无法解决糖向产物转化的问题。而有了代谢流分析，则使我们的调控更有方向性，本文便是通过提高OUR来达到使更多的糖转向产物这一目的的。     
相信本文作者后续还会尝试控制葡萄糖浓度的试验。因为葡萄糖浓度对于OUR可能更需要过程控制。       
    本文作者建立了一个简单的实时代谢流分析方法。基于这个模型，通过控制限制因素搅拌速度和对发酵培养基进行优化，从而使发酵水平提高了一倍，并使这一应用成功在应用于葡萄糖酸钠的工业发酵上。
   目前发酵工程师渴望更多的在线参数能够使用在发酵罐上，比如在线葡萄糖检测，在线粘度，在线OUR,CER等。但是当我们有了这些参数的时候，如果不能将其整合在一起，还希望进行单因素分析，则完全没有意义，甚至得到错误的规律。     
   当Master横扫围棋届的时候，让我们看到了复杂算法也有可能在发酵调控中应用，使我们能够更好的整合这些参数。同时调控工程师是否也应该有些担心，因为它会抢了我们的饭碗。