TA的每日心情 | 难过
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发表于 2012-2-21 17:51:42
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噬菌体检测方法
抑制检测
1. 原理
本实验能够证明在样品中是否含有阻碍细菌生长的物质。一个试管中接种菌种，另外一个试管加入菌种和待检样品。如果有酸化延迟的现象表明在样品中存在生长抑制物质。由于噬菌体能阻碍酸化作用，所以本实验能够用来检测噬菌体，例如乳清样品。
2. 应用
本实验能用来检测液体样品如乳清或发酵奶中的噬菌体，对于冷冻或冷冻干燥型产品中的噬菌体，如果样品能在实验前配制成溶液本方法同样适用。
抑制检测特别适用于混合的菌种，原因在于蚀斑检测法在此情况下不太适用。
3. 材料
– 再制脱脂奶(RSM), 9.5%, 115°C, 15 min
– 200 ml 灭菌瓶
– 20 ml 带盖试管
– 滤纸
– 离心机, 6000 rpm
– 灭菌吸管, (0.1, 1 和10 ml)
– 1/4-强度的林格氏溶液
– pH-计
– 0.45 μm 灭菌微孔滤膜
– 灭菌注射器
4. 取样和准备
为了避免在储存和运输过程中噬菌体的增殖或失活，乳清样品必须马上经过灭菌滤膜 (0.45 μm 孔径)和/或带着冰块条件下运输。如果使用的是干冰，那么样品中应加入15%灭菌后的甘油。如果运输的时间不太长，普通的冰块就足够了。
样品处理:
如果乳清样品在送到实验室之前没有过滤过，样品应用普通的滤纸进行过滤，然后取5 ml 在 6000 rpm 离心15 min。如果操作小心的话，有可能从样品上取得细胞计数足够低的乳清样品（上清液）直接用于实验。如果本方法不可行，那么则必须使用无菌过滤 (0.45 μm) 。乳清样品的使用：
1: 未稀释的
2: 稀释 1x10-2 和 1x10-4 (用 1/4-强度的林格氏溶液)
3: 热处理 90°C (194°F), 5 min.
5. 分析
对照/菌种
样品的检测可使用混合菌种或单一的菌株。
F-DVS 菌种 1 g稀释到100 ml RSM, 然后取 1 ml 稀释液加到100 ml 的RSM中（进行接种）
FD-DVS cultures 1 g 稀释 100 ml RSM, 然后取 0.1 ml稀释液加到100 ml的RSM中(接种)。
Redi-Set 1 ml 传代菌种加到100 ml RSM (接种)
检验
在灭菌的试管中加入10ml 接种后的奶 (稀释的对照样) ：
(A) 没有乳清的对照样
(B) 乳清样品 (或更多，取决于稀释次数), 添加0.1 ml 的样品
(B/90) 0.1 ml 热处理后的乳清样品 (90°C (194°F)，5 min)
(C) 对每一个乳清样品 10 ml 未接种的RSM
(没添加菌种) 都添加 0.1 ml 的乳清样品来检测在样品中是否存在干扰性的产酸物质。
温和的震动样品使之混合均匀，然后在乳品厂的培养添加下进行培养。当A样品的 pH达到5.5–5.0时，测量所有试管样品的 pH 。
实验计划:
RSM + culture
6. 结果判断
如果试管B中的 pH 与试管A相比差异 > 0.1则认为是阳性反应(稀释10–2 与未稀释的乳清样品相同)。但并不能完全确认噬菌体存在。当 高稀释样品的pH差异在 0.1个 pH单位时，则很可能是由噬菌体所造成的 (见备注)。
如果相同的抑制作用在试管B/90也发生，那么可能是由其它抑制因素所造成的 (例如抗生素)。
乳清有时候能够刺激菌种的生长，所以试管B的pH 有可能比试管A的pH 低。试管C中的 pH 不应该变化因为它应该不含有产酸的菌株。
要确认乳清中含有噬菌体，应进行蚀斑实验。
7. 安全事项
非常重要的是不要从乳清或其它样品传播噬菌体。所有的东西用过后，能进行灭菌的都要经过煮沸处理高压釜灭菌。
电极用水冲洗后应放在 70%的乙醇中一个小时。实验室工作台应用70% 的乙醇进行擦拭。
氯胺对杀灭噬菌体非常有效，但它会引起过敏因而要慎用。
8. 备注
实验时使用与乳品厂相同的发酵温度是非常重要的。测量pH 的时间也非常重要。空白试管中样品检测时的pH应 > 5.0 ，这是由于如果样品中含有很低量的抑制物质，会最终达到相同的pH。
抑制阳性的样品应送到科汉森在 Hosholm的实验室或当地的实验室来进行结果确认（蚀斑实验）。
如果抑制实验显示样品中存在抑制酸化的物质有可能有噬菌体之外的其它原因。(特别是在降低的稀释度时)。
蚀斑检验
1. 原理
蚀斑检验是一种琼脂覆盖法来对样品中的噬菌体进行计数的检测方法。
实验方法是在双层的琼脂之间混合噬菌体与菌种 (上层琼脂)。 单一的噬菌体会攻击细菌细胞并进行复制后释放出噬菌体来攻击临近的细胞并使之溶解。导致透明的蚀斑的形成。
2. 应用
这个实验专门用来检测乳清样品中的噬菌体。除了能确认噬菌体感染外还能显示噬菌体的效价(每毫升噬菌体的数量)。此方法还同时用来测试不同菌株对噬菌体的敏感和抵抗程度。
本实验的前提是使用的测试菌能够在平皿培养基上形成致密的细胞菌苔。
3. 材料
i) 含噬菌体的样品(例如乳清)
ii) O/N M17 宿主菌营养肉汤
iii) M17 琼脂平板，1.5% (或适当的生长培养基) 含 10 mM CaCl2
iv) M17上层琼脂， 0.7% 在沸水浴中加热直到培养基和琼脂溶解。冷却到55°C (131°F), 添加10 mM CaCl2
v) CaCl2 0.5 M 储备液
vi) 水浴 46°C (115°F)
vii) 沸水水浴
viii) 1/4-强度的林格氏溶液
4. 样品准备
为了避免在储存和运输过程中噬菌体的增殖或失活，乳清样品必须马上进行无菌过滤(0.45 μm 孔径) 和/或带着冰块条件下运输。如果使用的是干冰，那么样品中应加入15%灭菌后的甘油。如果运输的时间不太长，普通的冰块就足够了。如果乳清样品在送到实验室之前没有过滤过，在 6000 rpm 离心15 min，然后使用无菌过滤 (0.45 μm) 。
5. 分析
1. 在沸水中将琼脂融化然后在50°C (122°F)水浴中冷却。
2. 用1/4-强度的林格氏溶液对含噬菌体的样品按10 倍梯度进行稀释。
3.从每一梯度的稀释液中取 0.1 ml 样品加到不同的试管中并做重复。
添加 0.1 ml在M17营养肉汤中生长过夜的宿主菌株。
添加 0.1 ml 的 50 mM CaCl2 溶液，混合后在室温下培养10 使噬菌体吸附到宿主细胞上。
4. 添加 3 ml 50°C (122°F) 融化的上层琼脂，简单混合后将样品均匀的浇注在 M17底层琼脂上，凝固15 min。空白样品添加0.1 ml 1/4-强度的林格氏溶液来替代噬菌体样品。
5. 在 30°C (86°F) (对于for Lactococcus)，平皿面向上进行培养过夜。
6. 评价
检查长满宿主菌的平皿是否具有噬菌体所导致的一致的，清晰的溶解区域(蚀斑)。使用蚀斑数量在30和300之间的平板来计数。
7. 计算
计数平板上的蚀斑，计录每ml样品的蚀斑单位。
8. 安全事项
非常重要的是不要从乳清或其它样品传播噬菌体。所有的东西用过后，能进行灭菌的都要经过煮沸处理高压釜灭菌。
电极用水冲洗后应放在 70%的乙醇中一个小时。实验室工作台应用70% 的乙醇进行擦拭。 |
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