生物整理用纤维素酶活力的测定方法

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一 滤纸崩溃法

1 原理

    纤维素酶能分解滤纸，产生葡萄糖等还原糖，与3，5-二硝基水杨酸显色剂作用，可生成橙黄色络合物，用比色法能够定量测定还原糖的生成量。本方法在最适条件下，以单位时间内一定量的酶制剂释放出的葡萄糖量，来表示纤维素酶制剂的活力。

2 试剂

2.1  3，5-二硝基水杨酸显色剂

称取10g 3，5-二硝基水杨酸（熔点168-169℃，若熔点偏低，则应重结晶，方法是称取10g 3，5-二硝基水杨酸，加50mL水，加热溶解，冷却析出结晶，过滤，用冷水洗涤，干燥后得白色结晶），溶于蒸馏水中，加入20 g氢氧化钠，200 g酒石酸钾钠，加水500 mL，加热溶解后，加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠0.5 g，加热搅拌，待全部溶解后，冷却，移到1000 mL容量瓶中，稀到刻度，放置一周后过滤备用。此显色剂应贮存于棕色瓶中。

2.2        缓冲溶液

0.04M，pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

3             方法

3.1        酶液制备

按工艺要求的浓度、pH值等配制酶处理液。

3.2        酶解

分别吸取酶处理液0、0.5、1.0、1.5、2.0mL，置于试管中，用pH值为4.5 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足到2.0 mL。置于40℃水浴中保温数分钟后，在每管酶液中加入1×1cm2的新华1号层析滤纸6片，立即记时，准确反应60min，然后立即在沸水浴中加热10min，使酶失活。

3.3        显色

    在上述每管酶解液中，加入3 mL 3，5-二硝基水杨酸显色剂，在沸水中加热15 min，冷却，加蒸馏水10 mL，摇匀，用分光光度计在550 nm波长下，用1 cm比色皿，以空白为对照，测定其光密度。以光密度为纵坐标，各管酶浓度为横坐标作图，应成一通过原点的直线。取直线上任意一点计算即可。如成曲线关系（直线弯曲），应将酶液进一步稀释后再进行测定。

3.4        葡萄糖标准曲线绘制

    准确配制1000μg/ mL葡萄糖标准溶液。分别取0、0.10、0.20、0.30┄┄0.70 mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水补足到2.0 mL，加3 mL  3，5-二硝基水杨酸显色剂，同上进行显色、比色，以光密度（O.D.550nm）为纵坐标，葡萄糖微克数为横坐标作图，应得一直线。

3.5        计算

    在上述酶浓度和光密度对应的直线上取酶量W，对应O.D.550nm在葡萄糖标准曲线上查得葡萄糖的微克数A，按下列公式进行计算：

                            A

纤维素酶活力（单位/g）= ─────

                          t×W

式中：A —由标准曲线查出释放葡萄糖的量，μg；

      t —酶解所用的时间，min；

      W —反应中含酶量，g（若原酶制剂为液体，则以mL计，同时酶活力单位以单位/ mL计）。

单位定义：在上述条件下（pH值为4.5，温度为40℃），每分钟分解滤纸产生1μg葡萄糖的酶量，为1单位的酶。

摘自《印染》1994年第3期



二CMC粘度法

1测试仪器与方法

  仪器：NDJ-1 ROTATIONAL VISCOMETER  上海天平仪器厂

  计算公式：(1/V1―1/V0)×10000/10

  相对活力含义：在30℃水溶液中，1g酶作用于20g CMC，反应10分钟，相当于有10g CMC水解时，其相对活力为100。

2 操作：

    醚化度为85%的CMC，加水制糊配成1%的溶液；取纤维素酶加水配成1g/L的溶液；0.2M HAc溶液。三者按2∶1∶1混合（即15∶7.5∶7.5。中性酶则不加醋酸液，以水代之），在30℃条件下反应10分钟，在回转式粘度计上，用0#转子，转速6 rpm，注入混合液20 ml。

3  CMC的浓度—粘度混合液粘度：

CMC粘度（%） 0.5  0.4  0.33  0.25  0.2   0

粘度（mPa.s）   30   15    9   7.5  5.5  0.2

4计算

    酶活力= (1/V1―1/V0)×10000/10

V0 = 不加酶的CMC混合液粘度

V1 = 加酶后的CMC混合液粘度

    粘度7.5时，活力 = (1/7.5―1/30)×10000/10 = 100

    当样品混合液的粘度与浓度减半时的数值相同时，活力指标即为100。

    摘自第四届全国后整理学术讨论会论文集 1996年9月