创建酶法生产氨基酸新工艺

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三．创建酶法生产氨基酸新工艺  
  
【慨述】  
    酶促合成法制造氨基酸是在化学合成法和微生物发酵法的基础上建立和发展起来的一种新工艺。这一新工艺以化学合成法和微生物发酵法制造的某些物质作基质，在生物反应器内，经生物催化剂-酶催化合成光学活性氨基酸。化学合成法制造出的产物有各种DL-氨基酸，α-氨基-ε-己内酰胺，DL-乙内酰胺，2-氨基噻唑啉-4-羧酸；微生物发酵法制造出的产物有天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸。它们都可以作为酶促反应的基质。微生物发酵就其实质来说，也是一种酶促合成，不过，它以廉价的碳源，氮源，作为基质，经过多酶体系，多步催化反应生成氨基酸。多步反应，不可避免地带来产物成分复杂，转化率低，提炼收率低。酶促合成法用提取酶或静止期细胞，作为酶源，将已知化合物一步转化成已知光学活性氨基酸；基质，产物浓度高，成分单一，提炼收率高。因此，人们把复合酶多步催化的氨基酸发酵法称为“生物合成法”，而把单一酶一步催化的氨基酸酶促合成法称为“化学-酶催化法”，以示二者的区别。  
  酶促合成法制造氨基酸的突出优点是：专一性高，基质浓度高，转化率高，产物浓度高，提炼收率高，产品纯度高。生产周期短，亦可连续运转，成本低，经济效益高。  
  酶促合成法制造氨基酸与化学合成法和微生物发酵法相比较:   
1．酶促合成法制造氨基酸系单一酶一步催化反应，有利于生产过程的连续化，自动化，管理现代化。特别是固定化酶和固定化细胞应用于氨基酸生产，单位酶制造氨基酸的产量增加，生产成本大幅度下降。   
2．酶促合成法的最终产物结构，构型清楚，因为它是用已知化学构造“基质”作原料。况且原料是工业，农业产物或副产物，价格便宜。  
3．反应的立体特异性，是微生物发酵法和酶促合成法的主要特征。氨基酸有两种立体异构体，微生物发酵法生产的氨基酸是L-体。酶促合成法生产的氨基酸一般说来也是L-体，诸如酶催化不对称氢化，不对称氨化，不对称水解，不对称加成等反应，生产L-氨基酸。近年报道，用N-酰化-D-氨基酸酰胺基水解酶，D-乙内酰脲水解酶，3-氯-D-丙氨酸氯β-裂合酶，催化不对称水解，不对称加成等反应，生产D-氨基酸。   
4．相关氨基酸的合成成为可能。例如，酪氨酸酚-裂合酶，催化合成L-酪氨酸和L-多巴，双氢嘧啶酶催化合成D-苯甘氨酸和P-羟基苯甘氨酸，半胱氨酸脱巯基酶催化合成L-半胱氨酸和S-取代-L-半胱氨酸，β-氯-D-丙氨酸氯-裂合酶催化合成D-半胱氨酸和S-取代-D-半胱氨酸，蛋氨酸γ-裂合酶催化合成L-蛋氨酸和S-取代-L-高半胱氨酸。
5．酶促合成法较化学合成法节省能源，无环境污染物排放。 .  
    因此，酶促合成法制造氨基酸，获得迅速发展。以此相关的酶和微生物细胞固定化新技术，亦首先应用于氨基酸的酶促合成。1969年首次运用固定化氨基酰化酶，工业规模光学拆分DL-氨基酸。  
    在日本，田边制药公司，1973年首次运用固定化大肠埃希氏菌-天冬氨酸酶，从反丁烯二酸工业规模连续制造L-天冬氨酸，年产量达1000吨以上。东丽公司，1977年起，用L-α-氨基-ε-己内酰胺水解酶和D-α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶，直接从化学合成的DL-α-氨基-ε-己内酰胺生产L-赖氨酸，年产量达6000吨。三井东压化学公司，用L-色氨酸吲哚-裂合酶从L-丝氨酸和吲哚生产L-色氨酸，1983年初投产，年产量为200吨。昭和电工，用自己独立开发的半合成法，1982年在大分工厂内，建成年产量300吨饲料级L-色氨酸车间。味之素公司，从丙烯酸甲酯出发，经化学合成2-氨基噻唑啉-4-羧酸(ATC)，再在D-ATC消旋酶，L-ATC水解酶和S-氨基甲酰-L-半胱氨酸水解酶共同参与下，酶促合成L-半胱氨酸，1983年在九州投产，年产量为100吨。   
    兹将酶促合成法制造的氨基酸，列于表1.   
    表1. 酶促合成法批量生产的氨基酸   
氨基酸    基质    酶    酶源    基质浓度g/L  
(转化率%)   
L-氨基酸    DL-氨基酸    α-氨基酰化酶    Aspergillus Oryzae      
L-赖氨酸    DL-氨基己内酰胺    D-ACL消旋酶   
L-ACL水解酶    Achromobacter obae   
Cryptococcus laurentii    100(100)
D-苯甘氨酸    DL-苯乙内酰脲    D-苯乙内酰脲水解酶    Pseudomonas striate    100(95)

L-苯丙氨酸    DL-苯甲基乙内酰脲    DL-苯甲基乙内酰脲水解酶    Flavobacterium aminogenes    50(100)   
L-鸟氨酸    L-精氨酸    精氨酸酶    Streptococcus faecalis    50(100)   
L-瓜氨酸    L-精氨酸    精氨酸脱亚胺酶    Pseudemonas putida    160(100)   
L-半胱氨酸    DL-2-氨基噻唑啉4-羧酸    D-ACL消旋酶   
L-ACL水解酶  
S-氨基甲酰-L-半胱氨酸水解酶    Pseudomonas DN]  
thiazolinophilum    30(95)   
L-丙氨酸    L-天冬氨酸    天冬氨酸β-脱羧酶    Pseudomonas   
dacunhae    268(100)   
L-γ-氨基丁酸    L-谷氨酸    谷氨酸-α脱羧酶    Escherichia coli    80(100)   
L-色氨酸    吲哚,丙酮酸铵    色氨酸酶    Proteus rettgeri    63（98）   
L-酪氨酸    酚, 丙酮酸铵    酪氨酸酚-裂合酶    Erwinia herbicola    61(94)   
L-多巴    邻苯二酚, 丙酮酸铵    酪氨酸酚-裂合酶    Erwinia herbicola    59(95)  
L-天冬氨酸    反丁烯二酸铵    天冬氨酸氨-裂合酶    Escherichia coli    560(99)   
尿刊酸    L-组氨酸    组氨酸氨-裂合酶    Achromobacter liquidum    50(100)   
L-蛋氨酸    甲硫醇,α-丁酮酸铵    蛋氨酸-γ-裂合酶    Pseudomonas ovalis      
    酶促合成法制造氨基酸的研究，开始于六十年代初期，1969年正式投入工业化生产。有关酶促合成法制造氨基酸的报道，尚分散在各类刊物中，酶的分类命名不统一。我们编写酶促合成法制造氨基酸时，主要参考国际生化协会酶学委员会编著的“酶的命名法”1978年修订版，该书收集了2122种酶，酶促合成法制造氨基酸中所用到的酶，绝大部份被收载。这就为我们编写酶促合成法制造氨基酸时，带来了极大地方便，酶的分类命名得到统一，因为“酶的命名法”中，同时列出了酶的常用名称，分类命名称，其他名称（包括在书刊中用过的名称），还给出了酶的分类编号。本书，按照酶的分类，酶促合成法制造氨基酸中所用到的酶编号顺序排列，以“酶手册”方式描述每一种酶。表2是按照酶的分类编号顺序排列一览表。   
  
    表2. 酶促合成法制造氨基酸中所用到的酶分类   
酶分类类别    系统分类名称    分类编号 ,
氧化还原酶    L-丙氨酸: NAD+氧化还原酶（脱氨基作用） ):  
L-谷氨酸:NADP+氧化还原酶（脱氨基作用）   
L-亮氨酸:NAD+氧化还原酶（脱氨基作用）   
L-酪氨酸,四氢喋啶:氧化还原酶（3-羟基化）    EC1.4.1.1   
EC1.4.1.4   
EC1.4.1.9  
EC1.14.16.2   
转基酶    5,10-亚甲基四氢叶酸:甘氨酸转甲基酶    EC2.1.2.1  
水解酶    N-酰基-L-氨基酸酰胺基水解酶*   
N-酰基-D-氨基酸酰胺基水解酶   
α-氨基-ε-己内酰胺水解酶*   
D-乙内酰脲水解酶*   
L-乙内酰脲水解酶   
L-精氨酸脒基水解酶   
L-精氨酸亚胺基水解酶*   
2-氨基噻唑啉4-羧酸水解酶*    EC3.5.1.14   
EC3.5.1.x   
EC3.5.2.x   
EC3.5.2.2   
EC3.5.2.x  
EC3.5.3.1  
EC3.5.3.6  
EC3.5.4.x   
裂合酶    L-天冬氨酸-4-羧基-裂合酶*   
L-谷氨酸-1-羧基-裂合酶  
L-苏氨酸乙醛-裂合酶  
L-色氨酸吲哚-裂合酶（脱氨基作用）  
L-酪氨酸酚-裂合酶（脱氨基作用）   
L-天冬氨酸氨-裂合酶*   
L-组氨酸氨-裂合酶   
L-苯丙氨酸氨-裂合酶   
L-鸟氨酸氨-裂合酶（环化）  
L-半胱氨酸硫化氢-裂合酶（脱氨基作用）   
β-氯-D-丙氨酸氯-裂合酶（脱氨基作用）   
L-蛋氨酸甲硫基-裂合酶（脱氨基作用）    EC4.1.1.12   
EC4.1.1.15   
EC4.1.2.5
EC4.1.99.1   
EC4.1.99.2   
EC4.3.1.1  
EC4.3.1.3  
EC4.3.1.5   
EC4.3.1.12   
EC4.4.1.1   
EC4.4.1.x x   
EC4.4.1.11   
异构酶    丙氨酸消旋酶  
蛋氨酸消旋酶   
谷氨酸消旋酶  
脯氨酸消旋酶   
赖氨酸消旋酶   
苏氨酸差向（立体）异构酶   
2.6-LL-二氨基庚二酸2-差向（立体）异构酶  
羟脯氨酸差向（立体）异构酶   
精氨酸消旋酶   
氨基酸消旋酶   
苯丙氨酸消旋酶   
鸟氨酸消旋酶   
天冬氨酸消旋酶    EC5.1.1.1  
EC5.1.1.2   
EC5.1.1.3   
EC5.1.1.4  
EC5.1.1.5   
EC5.1.1.6   
EC5.1.1.7   
EC5.1.1.8   
EC5.1.1.9   
EC5.1.1.10  
EC5.1.1.11   
EC5.1.1.12   
EC5.1.1.13   
    分类编号的最后一个数字为“x”者，系“酶的命名法”1978年修订版未收集的酶。系统分类名称上注有星号者，是已投入工业化生产的酶类；从表中可以看出，基本上是水解酶和裂合酶，其它的酶类还处在实验室研究阶段。   
    可以预言，不久的将来，所有的氨基酸，都可以在连续反应器内，由“化学-酶催化法”来制造。我们确信酶工程的不断发展，将给人类带来巨大利益。     
    参考文献:   
1．ENZYME NOMENCLATURE，Recommendations(1978) of the Nomenclature Committee of the Internationl Union of Biochemistry，IUB，Published for the International Union of Biochemistry By Academic Press，New York San Francisco London 1979.  
2. 俞长銮.氨基酸酶法制造工艺的进展，国外药学,合成药,生化药,制剂分册，1981.3，pp10-20.   
3. 冯容保.氨基酸的酶法生产，天津微生物，1981.3，pp28-38.   
4. 熊谷英彦.酵素法アミノ酸合成，酵素利用技术の新展开，1981，pp121-131.   
5. 左右田健次.酵素による有机化合物の合成,化学工业とバイオテクノロジ，   
   1982,pp151-188.  
6. 詹豪强.氨基酸的酶促合成，化工生产与技术Chemical Production and Technology ，1999年第6卷第3期39-45.   
7. 孙志浩.酶法制备氨基酸，生物催化工艺学，化学工业出版社，2005，PP381-426.