高产脑黄金DHA的海洋微生物相关基因的克隆与表达的项目介绍

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" T5 w2 f' f& |  F& x  r) L8 w. t  G一、立项依据
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! A+ O1 s# p! P/ u6 i! d1.项目的意义：
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4 [& G% q2 g6 E; I& @: }' o/ V1 X4 F二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, 简称DHA)是人体十分珍稀的一种必需ω-3长链高度不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)。它是构成生物膜的重要组分,具有调节细胞构型, 改善膜透性, 调控离子通道蛋白基因的表达等多种重要生理功能,对人类的诸多疾病(如心血管疾病，癌症)和身体失调有治疗和预防作用。尤为特别的是, DHA以磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的形式聚集于人类大脑灰质和视网膜中，对大脑和视觉的正常发育及功能维持起了关键作用。DHA作为新型药物及婴幼儿绝对必需的功能营养要素已获得了世界卫生组织的充分认可。
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8 L/ A+ ~; \2 |" p5 WDHA是一种具有特殊化学结构(非共轭体系的6个顺式构型双键)的多烯脂肪酸，不仅难以化学合成，而且只存在于特殊的海洋生物中。其传统的商业来源主要是鱼油（沙丁鱼和金枪鱼），相关的DHA产品也已在日本和美国开发成功。我国研制的脑黄金和脑白金也是含有DHA的鱼油制品。然而，鱼油在品质方面难以满足人们对DHA市场的广泛需求。这主要是因为 ①.海洋鱼油脂肪酸的组成极不稳定，随季节，产地，鱼种及其食物链（即海洋微生物类群）而发生显著变化；②.鱼油所具有的难闻腥味给下游纯化制备工艺带来很大的麻烦；③.鱼油制备过程的氢化反应，导致了多数PUFA的破坏,降低了鱼油中DHA的含量；④.海洋环境污染导致的鱼类所富积的重金属和二恶英等有机污染物都有可能对人体造成伤害,因此, 探求新的DHA来源就变得十分迫切。
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近年来的研究表明海洋破囊壶菌Thraustochytrium是优良的DHA产生菌,其单细胞油已被确认为是鱼油的理想替代品。在Thraustochytrium细胞中，DHA是在一系列前体脂肪酸（包括α-亚麻酸,花生四烯酸，二十碳五烯酸EPA和二十二碳五烯酸DPA）的基础上，通过碳链延长和脱饱和反应而实现的。而催化这两种反应的酶系分别为碳链延长酶(elongase)和脱饱和酶（desaturase ）。由于两者均属于细胞膜结合蛋白,所以它们的分离纯化较胞外酶困难的多。这也使得要在细胞水平上调控DHA生物合成变得十分困难。所以利用分子克隆技术，研究与DHA生物合成密切相关的脱饱和酶和碳链延长酶的基因结构及其表达调控就成为了必然。由于将这些稀有的海洋功能基因“登陆”并在真核系统中表达，进而构建转基因酵母来生产DHA具有极高的商业价值，所以分离和克隆与DHA合成相关的基因就变成了近年来海洋生物技术领域的一个热点。
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1 y; l+ j) {2 i6 Z2. 现状分析：
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Thraustochytrium aureum和Thraustochytrium resu是目前国外常被选用的试验材料，但由于它们积累的中间体PUFA含量不高，仅克隆成功Δ4-desaturase和Δ6-desaturase基因，其它的脱饱和酶(包括Δ5-desaturase, Δ9-desaturase, Δ12-desaturase)以及碳链延长酶(elongase)基因尚未克隆成功。因此选择别的合适的试验材料，就显得十分重要。尽管许多人致力于探求新的高产DHA破囊壶菌的资源,但由于没有合适的分子标记,新资源进展缓慢。我国高度不饱和脂肪酸的研究始于二十世纪八十年代, 主要工作集中于利用丝状真菌生产γ-亚麻酸(GLA), 花生四烯酸(AA)以及从鱼油中提取浓缩制备DHA。利用Thraustochytrids生产DHA的报道很少，有关破囊壶菌DHA生物合成相关酶的克隆与表达更是一片空白。

  \! d! N5 j5 c$ v/ s! H黄建忠教授利用松花粉垂钓法,以18S rRNA基因为分子标记,首次建立了快速鉴别高产DHA的海洋破囊壶菌Thraustochytrids的新方法,并筛选到一株不仅可大量合成DHA而且可累积许多中间体高度不饱和脂肪酸(包括C20:4n-6, C20:5n-3, C22:5n-6)的优良菌株Thraustochytrium sp. KK17-3。该菌株含有丰富的与DHA生物合成密切相关的酶系，可作为克隆与DHA合成相关酶的理想材料。
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# V+ V* N% Y8 A本项目的研究不仅有助于揭示破囊壶菌DHA生物合成过程中脱氢酶的结构功能与脱氢机理，阐述DHA生物合成的分子机制，而且能为转基因技术生产高度不饱和脂肪酸奠定基础，具有重要的学术价值和开发应用前景。

3 F% J. V5 f( g* u二、         项目已有的工作基础与条件
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1.已有的研究工作基础：

黄建忠教授领导的课题组在国家自然科学基金、福建省科技厅重大项目和福建省发改委项目的支持下已经完成了以下工作：
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9 x, t* c: S  Q① 已通过18S rRNA基因的标记技术分离成功优良的DHA产生菌；

; A* p; d# L) ~6 H② 利用RT-PCR结合RACE技术路线已从该菌中已成功克隆Δ6-desaturase 和碳链延长酶（C18-C20）elongase 基因；
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( Q' y5 `+ O& b/ ?! l③ 本研究涉及的实验方法在本实验室已成熟掌握，课题组对完成该课题充满信心。

2.现有的条件：

0 n) J$ L1 g/ L# g* L" P本课题是以工业微生物教育部工程研究中心和福建省现代发酵技术工程研究中心为重点依托，实验条件优越，设备先进，具备完成本项目所需的仪器设备。

& L, F  j8 Y% w- c( P/ i本课题的总指导老师黄建忠教授现为“教育部高等学校生物工程与生物技术专业教学指导委员会”委员、福建省“百千万人才工程”第三层次人选、“工业微生物教育部工程研究中心” 主任、“福建省现代发酵技术工程研究中心”主任、福建省“发酵工程”重点学科带头人、福建师范大学生命科学学院副院长。从事微生物生物化学与分子生物学的科研与教学工作。先后主持参与了国家自然科学基金、国家攻关、国家火炬高新技术、省重大攻关、省自然科学基金共20多项课题的研究。获国家发明金奖1项、省科技进步二等奖2项、省科技进步三等奖1项。发表40多篇论文。
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3 ]' N  y5 A! T& i1 [% o% n本课题已有三个相关的科研项目，总经费达88万元，能为该课题提供资金保证
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& K# T$ X0 Z3 R/ Q三、项目实施方案及实施计划

1、具体研究内容、研究目标和拟解决的关键问题
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* Z6 X1 y0 ]+ k1.具体研究内容：
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① 优化破囊壶菌Thraustochytrium sp.KK17-3 在低温 (10-15℃) 培养条件下,合成总PUFA(包括DHA,DPA,EPA和AA)的最佳条件,以便制备高丰度碳链延长酶和脱饱和酶基因的mRNA样品。
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; K( G  i! j( f+ ]7 ?; T6 r+ m② 酶基因克隆与序列分析：
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9 J# M" w3 ]6 G. _7 dⅠ. 利用RT-PCR技术扩增出目标基因片段。根据已报道的植物,动物,酵母的碳链延长酶和脱饱和酶的三个组氨酸box的保守序列,设计出简并引物。将通过RT-PCR技术扩增出的目标基因片段(600-700bp)连接到pGEM-T Easy Vector，转化E.coli DH5α,蓝白筛选获阳性克隆子,T7或SP6为引物测序；
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Ⅱ. 获得完整cDNA序列。根据上述目标基因片段的序列设计出nested 引物， 以3′RACE法和5′RACE双向扩增成熟肽基因片段并获得完整的开读框。在启动码和终止码的两侧设计一对引物，通过PCR获得完整的cDNA；
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# M, U3 S2 L+ P4 }# G1 {$ LⅢ. 酶基因组DNA的克隆和序列分析，依据序列的编码区外侧设计一对引物，通过PCR扩增获得酶基因组DNA全序列；
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; I5 I6 ?! e9 N/ _/ qⅣ. 根据上述已获得的酶基因序列，推导其氨基酸组成，计算出分子量。
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; C. Q6 ]. k2 I5 E# g③ 酶基因表达：
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Ⅰ. 酶基因在大肠杆菌中的表达。构建大肠杆菌表达载体，在半乳糖起动子的控制下,经乳糖诱导实现酶基因在大肠杆菌中有效的基因表达,以便确定基因的功能；

Ⅱ. 酶基因在酿酒酵母中的表达。通过电转化等手段完成酶基因在酿酒酵母中有效的表达；
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Ⅲ. 实现碳链延长酶和脱不饱和酶基因在酵母细胞中的共表达。

( t9 R9 @5 D2 S+ n' U" D) b2.研究目标:

) B% ~/ N- i0 B① 获得海洋微生物Thraustochytrium DHA合成相关的碳链延长酶和脱饱和酶基因的全序列。它们是一组新的基因序列，为后续构建工程菌生产DHA奠定坚实的基础；

. n- z# X$ u- ]4 j5 L: ~/ L② 实现脱饱和酶和碳链延长酶基因在酵母中的表达；

$ u3 ^' R" x- L! A8 m& A③ 获得数个转基因酵母生产DHA的前体功能性脂肪酸。

3.拟解决的关键问题:

① RACE方法克隆基因的技术存在有一定的难度：

RACE方法克隆450-800bp基因片段的经验，本基因成熟肽长度根据其分子量推测1000-1200bp，以RACE方法扩增的是成熟加上完整3′非翻译区，若3′非翻译区长度比较大，采用RACE方法克隆该基因是否有难度？

如果通过RACE方法扩增该基因遇到困难，可采用如下方案：建立酶cDNA文库，通过筛选获得该酶基因，并测序得到其完整基因序列。

（注：经过努力目前已通过RACE方法扩增到该基因）

② 表达蛋白的活性：

: z3 U6 ~! n2 L9 w, ?+ x微生物酶基因在进行活性表达时常遇到一些困难，综合国外有关的报道这种情况出现的原因可能和解决方法是：

* e, E: f  ~; D! U( I' D8 x8 ZⅠ. 适宜载体和表达系统的选择：外源酶可见表达质粒的种类不同可影响到表达蛋白的功能，因而选用适宜的载体和表达菌很关键。
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Ⅱ. 分子伴侣的协同表达：来自---脱不饱和酶在酵母中的表达需要其上游基因编码的细胞色素b5的存在,有助于提高起酶活性，若该酶蛋白属于此类性质，应考虑确定和克隆其分子伴侣基因，进行共表达研究。

% W5 i5 n, x* H& L6 p5 G, U2、实施方案、实施方法、具体实施计划（含年度进展情况）及可行性分析
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1.拟采用的研究方法：
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①       根据已报道的植物,动物,酵母的碳链延长酶和脱饱和酶的三个组氨酸box的保守序列,设计出一组简并引物,用于RT-PCR扩增出的目标基因片段(600-700bp)。
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②  RT-PCR
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Ⅰ. 制备总 RNA：Thraustochytrium sp.KK17-3经低温菌种培养后，抽滤收集菌丝体，并按照CsTFA密度梯度离心法制备RNA；
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Ⅱ. cDNA第一链的合成：以总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物，在Expand 反转录酶的作用下合成cDNA第一链；

$ |' R4 V$ _  Z) CⅢ. 以合成的cDNA第一链为模板，94℃变性3分钟后，加入Taq DNA聚合酶，进行PCR 循环，反应参数为94℃变性30s，55℃退火1 min，72℃ 延伸1min。30次循环后，在72℃ 延伸10min。4℃保存；
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, ~+ F2 Q0 [0 K- |3 ?* W$ PⅣ. 扩增PCR的克隆和重组子筛选：PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，切下相应大小的目的条带，低熔点琼胶纯化回收,并连接pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选鉴定阳性克隆子；

Ⅴ.克隆片段的DNA序列分析: 具体操作按PE公司的试剂盒所附方法进行。

/ J$ B! E6 j3 Z( f/ Y7 T②     用3′RACE 和5′RACE方法扩增：根据已知的片段序列,设计一组引物,通过3-RACE 和5-RACE方法获得完整的开读框,到的目的基因片段与载体PbluescriptII SK（+）连接，以T7、SP6引物测序，获得酶成熟肽cDNA序列。至此，我们可获得编码该酶的cDNA全序列。

④ 据此序列在编码区外侧设计一对引物，以genomic DNA为模板，PCR扩增该酶基因组DNA片段进行克隆、测序分析，获得完整基因组DNA序列。

8 r8 t6 M+ J& b) P( W5 H⑤ 计算机软件分析获得的酶cDNA全序列及基因组DNA全序列，推导该酶的氨基酸全序列，分析内含子等基因结构。

# Z% A$ n! X1 v! o, p: W⑥ 确立适宜的表达系统。
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2.实施计划（含进度安排）：

① 2007.3-2007.6

优化破囊壶菌Thraustochytrium sp. FJN-10 DHA合成的条件并制备高丰度脱氢酶基因的总RNA样品。利用组氨酸保守区域设计简并引物，运用RT-PCR结合RACE克隆酶基因全长。
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- j/ Q- p  }1 Q) R* _② 2007.7-2007.12

1 @  h* B& M5 Y7 i# D利用醋酸锂转化法，将重组质粒转化到酿酒酵母中，根据进化树的预测，添加前体脂肪酸，半乳糖诱导后收集菌体，提取油脂，气相色谱、质谱鉴定脂肪酸的变化。
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③ 2008.1-2008.2

③     做总结报告
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低温培养Thraustochytrium sp.kk17-3提高目标mRNA丰度

CsTFA密度梯度离心制备总RNA
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- y$ l& U( |# c8 s2 {) o) x纯化mRNA

" g- S4 D1 U# ^$ k* ERT-PCR获得目标片段
5 J; t8 B* g4 `5 X1 C4 K9 w! d
根据酶His box 的高度保守序列设计引物
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连接pGEM-T Easy Vector

) O. ]& k9 I& T" ]转化E.coli DH5,蓝白筛选获阳性克隆,制备重组质粒测序

3′RACE和 5′RACE,获全长cDNA
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连接pYES, 转化釀酒酵母
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2 o* v( s- ^6 h% J: H添加前体脂肪酸, 乳糖诱导表达

气相色谱, 质谱分析表达产物

, K5 H# x- J) U4 K3.技术路线：

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; s7 u" ~, Q4 K  ?- m4.可行性分析：

① RT-PCR并结合cDNA末端扩增（Rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆FAD是行之有效的技术方法。黄建忠教授利用该技术方法已从海洋真菌Thraustochytrium sp中获得了一个FAD完整开放阅读框（GenBankQ133575)。

  @5 O+ ~8 P& {' e② 所选择的表达体系适合FAD的表达。酿酒酵母S.cerevisiae 自身不能合成DHA，避免了内源性脂肪酸对FAD表达的影响。此外酵母S.cerevisiae InvSc1 是尿嘧啶营养缺陷型菌株，在选择压力下，只有转入了外源重组质粒，才能正常生长，保证了重组子的筛选。

③ 人才与仪器设备足以支撑该课题的顺利进行。本课题组成员专业知识层次高，人员梯队合理。课题组成员掌握本次申请项目所需的微生物、生物化学、分子生物学等各项实验技术以及生物信息学计算机处理能力。此外，该有“工业微生物教育部工程研究中心”、“福建省现代发酵技术工程研究中心”、“福建省发酵技术科研平台”和“工业微生物高通量选育与保藏技术研发平台”做为依托，拥有完成实验所需要的重大仪器。

我们研究小组有信心按期高质量完成本项目的研究工作。
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3、  项目预期的成果和效果（包括成果形式、数量、实施范围、受益学生数等）

- J4 ?0 ^; R5 C. Q1 F4 M$ f1.     获得延长酶与脱饱和酶基因序列，并登陆美国国立生物信息中心（NCBI）；

. n0 G2 r6 o7 Q- N  I! j) P2.     得到2～3个GeneBank号；

3.     培养4～5名掌握基因工程及其生物信息学基本研究方法具有独立思考的本科生。
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, T2 T7 `* X" P9 b5 N4.     本项目的特色与创新之处
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1.研究菌种的新颖性：

本研究采用的菌株Thraustochytrium sp. KK17-3 是我们自己分离成功的一株理想的高产DHA产生菌，不仅可合成大量的DHA，还能积累许多的中间PUFA。

: j, j- ^9 e( O8 J4 u6 H2.拟克隆的基因属于海洋生物珍稀功能基因，具有广阔的商业开发前景：

对海洋真菌Thraustochytrids碳链延长酶（elongase）和脱饱和酶（desaturase）基因的克隆在国内尚无人涉及，是一个明显的创新。本研究的成功可获得与DHA合成相关系列酶系的完整cDNA序列,为后续构建生产DHA的转基因酵母奠定基础，具有广阔的开发应用前景。
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9 }3 O- n4 y8 A3.方法学的创新：

本研究拟采用近年发展起来的RT-PCR 并结合3′RACE和5′RACE方法路线克隆酶基因。与基因克隆的经典技术路线（构建DNA或cDNA文库，合成引物探针，筛选基因文库）相比，该方法具有高效快速的优点。
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* {9 L! }& N: j# L2 j8 i! M' c  h 福建师范大学生物学实验教学中心