A0X1基因的表达为转录水平调控

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A0X1基因的表达为转录水平调控

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A0X1基因的表达为转录水平调控。 以甲醇为碳源时，生长细胞中约5％mRNA来自于A0X1基因。A0X1基因的调控是两步过程：抑制机制加上诱导机制。即在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转 录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录，蛋白表达。最近在P．Pasotris中克隆到一个组成型启动子：PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)，在它控制下的p.Lacz基因表达 率比甲醇诱导下的以PAOX1为启动子的产量更高。由于该组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更为简单，产量高，所以它是一个很有潜力的启动子。

2、选择标记

选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因，常用HIs4。由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作为标记。AMP：氨苄抗性基因，可在大肠 杆菌中筛选。G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是筛选标记，使得到高拷贝的转 化子，这是因为表达载体上外源基因和卡那基因相偶联。Zeocinr在E.coli和P.Pastoris宿主中都表达，因此缩短了穿梭载体的长度，但Zeocin是一种强诱变剂，可能导致转化子产生突变。

3、信号肽序列

表达蛋白的分泌需要信号肽引导并沿一定途径才能分泌至细胞外。P.Pastoris自身分泌的蛋白质很少，分泌表达是一种理想的表达方式，胞外表达有利于蛋白质的提取和纯化，同时有助于不分泌型的蛋白质使其分泌，而像人血清蛋白(HSA)和牛凝乳酶(Rennin)，用自身信号肽序列即可在P．Pastoris中成功表达。然而，对于有些蛋白的自身信号肽，P.Pastoris不能有效利用，如反转录酶。

甲醇营养型酵母表达系统一般利用2种来源的信号肽序列：一是外源基因本身携带的信号肽序列；二是来源于酵母的信号肽序列，如a-因子、PHO1信号肽序列。P.Pastoris信号肽主要包括磷酸酶(PHO)、转化酶(inertase)和α-因子，其中α-因子信号肽( MF)使用最广。

α-因子信号序列是由87个氨基酸组成，来自于S.cerevsiae的α性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插入到几个P.Pastoris的表达载体中(Invitrogen)。在构建α-因子信号肽融合基因时，需保留KeX2蛋白酶切位点附近的谷氨酸一丙氨酸(Glu-Ala)间隔区，GluAla的存在会避免错误切割的发生。研究证明：信号肽引导的外源蛋白在P.Pastoris中均能被有效切割。α-MF是在高尔基体中被KeX2蛋白酶识别并切割，而PHO1一般在内质网被切割。

酵母细胞对信号肽序列的识别有一定的灵活性，在一定程度上可以识别外源蛋白的信号肽进行蛋白输送，但利用外源基因自身信号肽序列不能得到高表达量和高分泌效率。来源于P.pastoris酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的信号肽序列也常用于甲醇营养型酵母表达载体，由该信号肽引导的蛋白一般仅能分泌至膜周质，分泌效应不如a-因子信号肽强。

4、载体

（1）表达载体种类

有几种甲醇酵母是用于表达外源蛋白的受体菌，如GS115，KM71和SMD1168等，它们都是组氨酸缺陷型。如表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氢酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8，通常不予考虑。GS115表型为Mut+。重组表达载体转化GS115后，长出的转化子既有可能是Mut+，又有可能是Muts，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。 SMDI168和Gsll5类似，不同的是它是蛋白酶缺陷型，可减弱蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71没有AOX1基因，本身就是Muts，因此转化后所有的转化子都是Muts，不必鉴定表型。

llyy2221

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