阿维菌素的菌种研究进展

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除虫链霉菌(Streptomyces avermitills)是十六元大环内酯类抗生素阿维菌素(avermectln)的产生菌，该抗生素含有8个结构相似的组分，分别为Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Blb、B2a、B2b。其中Bl 组分生物活性最强，它是考察除虫链霉菌发酵水平的主要指标。由于它对多种家畜体内外寄生虫及农业害虫具有高效杀虫活性，越来越引起人们的关注。多年来，众多学者已经对该菌采用了各种不同的方法改良菌种的遗传特性，为提高有效组分B的含量做了大量工作。作者采用亚硝基胍作为诱变剂，在分离平板中加入1 g·LI1甲硫氨酸，挑选在甲硫氨酸平板上生长快的菌落，获得B。结果表明这种方法对提高产生菌B组分的产量是有效的。

多年来，众多学者已经对该菌采用了各种不同的方法改良菌种的遗传特性，为提高有效组分的含量做了大量工作。

我公司工作人员在前人研究的基础上总结并试验了以下几种方案

1.采用亚硝基胍作为诱变剂，在分离平板中加入1 g/L甲硫氨酸，挑选在甲硫氨酸平板上生长快的菌落，获得Bla组分显著提高的菌株。结果表明这种方法对提高产生菌Bla组分的产量是有效的。

2.NTG诱变处理

称取一定量的NTG溶解于10％甲酰胺溶液中，再用pH6．0磷酸缓冲液稀释至一定质量浓度后加入到制备好的孢子悬浮液中混合，使其最终质量浓度为1 g/L、2 g/L 、3 g/L ，于28℃ 振30 min。挑选平板上生长快的菌落，获得Bla组分显著提高的菌株。结果表明这种方法对提高产生菌Bla组分的产量是有效的。由试验数据可知NTG的作用质量浓度在1 g/L时诱变效果最佳。与出发菌株相比，正变率达到13．3％，正变率大于其他处理条件，负变率低；随着NTG质量浓度的增加，孢子死亡率逐渐增加，正变率逐渐降低，负变率逐渐增加；当NTG质量浓度达到3 g·L-1时，正变率为零，负变率达到86％。根据以上结果确定了以低质量浓度(1 g·L-1)NTG作为本实验的诱变剂量。


3.Met平板筛选

将一定量的Met溶于蒸馏水中灭菌后加入到分离培养基中，使其最终质量浓度为0．1~0．3 g g/L，制备成分离平板。将NTG处理后的孢子悬浮液稀释后涂布在分离平板上，28℃ 倒置培养8 d。挑选平板上生长快的菌落，获得Bla组分显著提高的菌株。结果表明这种方法对提高产生菌Bla组分的产量是有效的。我们将出发菌株的孢子悬液在NTG作用质量浓度1 g/L 、28℃ 恒温振荡的条件下处理30 min，梯度稀释后涂布在含有不同质量浓度Met的分离培养基平板上，待菌落长好后，统计各皿的菌落数，计算死亡率。并随机挑选单菌落传斜面，斜面长好后进行摇瓶发酵，以HPLC法测定各个菌株总阿维菌素的生产能力及B组分的生产能力，根据实验数据可知加入Met后。孢子死亡率明显上升，阿维菌素产量正变率(产量正变菌株的比例)较单纯NTG诱变有所下降，负变率增加，B组分比例正变率有较大上升。加入1 g/L的Met，使B组分比例增加的菌株达到15．75％。随着Met质量浓度升高，菌落生长受到抑制，孢子明显减少，B组分比例正变率有所下降。

4.固体发酵初筛

将培养好的各个平皿中的单菌落，随机挑取接斜面，在28℃ 培养8 d，孢子生长成熟后，用高压液相进行效价测定，根据测定结果挑选高产菌株进行复筛。将分离筛选获得的变异菌株M一20进行摇瓶复筛，用HPLC法测定阿维菌素产量并与出发菌株进行比较。可以看出新菌株的B组分含量为82．1％，较出发菌株的B组分含量71．6％提高了14．6％ ，而且B1a的产量也提高了19．3％ 。在试验过程中，通过观察可以将菌株的形态特征比较发现获得的新菌株与出发菌株比较，形态上有明显的差异，菌落直径约为2 mm，较出发株菌落径略小，形态为草帽型，产孢子能力强。孢子量大。

5.液体摇瓶复筛

从初筛得到的高产菌株斜面上铲取0．5 cm×0．5 cm大小的培养物接种于种子摇瓶中，在220 r/rnin/摇床上28℃培养24 h后，以5％/的转种量接种于发酵摇瓶中，于220 r/rnin/摇床上28℃ 培养7 d，用HPLC法测定阿维菌素的含量。

实验证明：

(1)这几种诱变方法处理S-P-5时，菌株产生正突变率较高，是一种通过诱变筛选获得高效目的菌株的有效手段。

(2)对筛选获得的高效突变菌株A-3-15进行摇瓶发酵条件的优化，其有效组分B 的含量较优化前提高幅度较大。

(3)Avermectins产生菌的菌落特征很不稳定，存在严重的自然分化现象，在不同菌落形态的分化菌株中，灰色孢子的菌株能产Avermectins，但即使经单孢子选出的灰色菌落经传代后，仍分化出不产Avermectins的白色和光秃菌落，因此诱变处理后应从分离培养基上挑取产抗能力强的灰色孢子进行发酵培养，以平衡经常出现的发酵效价不稳定现象。

到目前为止,经过我公司研究人得不懈努力,使阿维菌素得效价得到了较大幅度得提高,比现有水平提高了大约近40%,21世纪是一个环保生态世纪,农药发展要服从于可持续发展的战略目标,生物源农药必然是杀虫剂研究的热点。阿维菌素作为一种具有独特杀虫机制的低毒害生物农药,势必会引起越来越多的关注。