TA的每日心情 | 怒 2020-6-29 17:24 |
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1、细胞的碘化丙锭(PI)染色
PI和溴化乙锭(EB)为同类物质,与EB一样,PI嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI染色的荧光强度约为EB染色的1.8倍,以488nm波长激发,DNA-PI复合物最大的发射波长约为615nm。
(1)小鼠Lewis非癌细胞(3LL)DNA含量测定方法
①从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗。
②去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块。
③小碎片移入1.20 x 38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。
④向200-300ul细胞悬浮(5 x 10^5个/ml)中加入3ml PI(50ug/ml)染色3LL细胞,于4℃存放20-30min。
⑤测定580-750nm之间的发射荧光,以去除未结和PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。
PI染液:0.1%柠檬酸钠1000ml+PI 5mg+1%蒸馏水
(2)培养细胞DNA的流式细胞仪分析
①从培养皿中吸去培养基,以HBSS冲洗2次。
②加入PI 5ml于培养皿中,在4℃放10min。
③用吸管反复吹打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。
(3)完整细胞DNA的PI染色
①70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液。
②室温条件下加入PI染色一批细胞(105-106个/ml),时间为30min,然后行流式细胞仪分析。
(4)光辉霉素和PI的DNA 染色 在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。
①分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存1周,
②以PI/光辉霉素染色,4℃1h(PI为10mg/L、光辉霉素为10mg/L)。
③染色后进样,以100W汞灯作为激光光源,使用BG123nm阻断滤片,叠加K590型高通滤器。 |
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