菌种衰退或污染后怎样进行菌种分离?

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为了使已经衰退或污染了的菌种恢复其原有的性状和能力，一般要进行纯种分离，将所得的若干单株，再进行糖化力或发酵力的比较测定。从经典的孟德尔遗传基本定律可知，各遗传性状在子代中逐渐分离，但在同一群体中由于遗传性的稳定性，其中也还存在着未衰退的部份，或者经过与环境的适应，使之具有较母株更优越的遗传性状。采用纯种分离技术，可以从衰退或污染的菌株中，得到性能优劣不同的纯种，然后，通过菌种性能的测定，得到生产所需要的菌株。常用的分离方法如下：

(一） 平面划线分离培养法

1．准备工作：

①培养皿灭菌：培养皿用纸包好，用湿热灭菌法灭菌后，再用于热灭菌法灭菌，现用现灭，不宜放置过久。

②培养基灭菌：每支试管装培养基10―15毫升，棉塞用纸包好，在蒸汽灭菌时避免和蒸汽直接接触；溶化琼脂时，最好用蒸汽，如用水浴溶化，要防止沸水打湿棉塞。

③试验材料：除按常规接种条件准备所需的仪器设备外，另取3―5毫升的无菌试管1支，新鲜供试菌株试管1支；无菌培养皿3套；玻璃铅笔1支。

2。划线分离：

①菌液稀释：取供试菌株和无菌水试管各1支，按无菌操作法挑取一接种耳打匀，制成菌悬液。

②划线：将试管培养基冷却至50℃，按无菌操作法将试管琼脂倾入培养皿。把培养皿编号(例如1、2、3)，待琼脂凝固后，仍用无菌纸包好。放入30℃温箱，蒸发表面的凝集水，经过2―3小时，使水汽集于皿盖，然后取出，按无菌操作法，在接近火焰处揭开培养皿，至恰好金属环伸入培养皿，蘸取一接种耳菌悬液，在皿盖的汽水中涂抹稀释，然后用接种耳在琼脂上自由划线。开始时可近乎是涂抹，然后一举划线，中间不要停顿，划成约6毫米间距的线条，迅速盖好皿益倒转培养皿。通常不用再蘸新菌液，迅速划二号三号培养皿，无疑可以得到越来越稀的单个菌落。

③培养：将所有的培养皿倒置，用无菌纸包好，在指定的温度下培养，待菌落长成后挑取单个菌落，移接于新的斜面，即得单株纯种微生物。以上方法仅适于细菌和酵母分离。

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(二) 平面稀释琼脂倾注分离法

1．准备工作；

见划线分离法。但培养基的酸度可稍大，至琼脂不因酸度太高而不凝固为止。

2．分离操作：

以曲霉为例。将无菌水、无菌琼脂试管、无菌培养皿分别编号为1、2、3。琼脂试管在蒸汽或水浴上溶化并冷却至55℃，移入接种室55℃水”Ｎ隆０次蘧僮鞣ㄈ」┦郧咕暌唤又侄谖蘧1号试管中，摇匀并洗吸管三次，在吸取1毫升菌悬液于2号无菌水试管中，用同样方法洗吸管后摇匀，依次稀释第三支无菌水试管。先吸取3号无菌水试管制备的菌悬液1毫升于3号琼脂试管中，迅速摇匀，或用手搓试管使菌液均匀，注意不要使棉塞沾有培养基，立即氢入3号培养皿；按同样的方法顺次吸取2号菌悬液于2号琼脂试管，例入2号培养皿，直至做完l号培养皿为止。待琼脂凝固后倒转培养皿，用无菌纸包好，送入30℃温箱中培养，通常三支试管即可得到单菌落。

本法适用于细菌、酵母、霉菌等多种微生物。按本法的原理，将菌种定量，无菌水定容。例如，取曲种1克，无菌水99毫克或9毫升，可分别得到100、1000、1000、10000……的稀释倍数，如法倾入培养皿，待菌落全部长成后，进行微生物计数。一般每个培养皿有细菌菌落60―80个，酵母菌落40―60个，霉菌菌落20―30个即可。数菌落时一律用玻璃铅笔圈位，三个同一稀释度的平行试验菌落，误差不得超过10％。取其平均数，则微生物的细胞数(个／克样品)，等于菌落平均数×稀释倍数。

3．挑取单菌落：

将分离好的培养皿菌株，培养24、36、48……小时后，取出观察菌落生长情况。对于霉菌，常常是挑取幼年的菌落，即菌落刚露出生长物，连同琼脂一起挖出，移植于新的斜面培养基上，要多挑几株培养，用于糖化力的比较测定和取舍。也可在菌落长成后，挑取需要的菌落进行培养，但这样做往往因菌落扩张，而有碍单株的挑取。为了防止菌落扩张，可在琼脂培养基内加0.02％的去氧胆酸钠，或少许山梨糖，或硫酸十二酯等，加以限制。

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(三) 纯种的分离

在纯种分离工作中，为了获得纯种，通常采用各种条件以控制杂苗的繁殖。主要采取的方法，是利用分离微生物的各种特性，发展所需要的纯种微生物，抑制有害微生物。操作要求如下：

1．营养条件的控制：

例如，分离曲霉用察氏培养基，控制其营养在最低限度，防止菌落的过份扩张，分离酵母用麦芽汁琼脂，不仅有利于酵母生长，而且能限制芽孢杆菌的扩展，还可以根据所分离菌种，能同化某些碳源或氮源的特点，限制其它杂菌的生长，如分离汉逊酵母以乙醇为唯一碳源等。

2．酸碱度的控制：

如分离霉菌，在培养基中加入乳酸，可以控制杂菌的生长。

3．特殊生理特性的控制：

如分离酵母菌，可利用酵母耐酒精的特性，在培养基中加入2％以上的乙醇，以抑制许多其它微生物的生长。典型者如红曲霉分离，可加乳酸至1％以上，加酒精至8％（V/V）。从严重污染物中分离纯种，采用特殊抑制剂的方法很多，如分离放线菌时，加入苯酚数滴，可抑制霉菌生

长；青霉素对格兰氏阳性菌有抑制作用，而对格兰氏阴性却作用甚微；四环素能抑制细菌，但对酵母、霉菌则很少有抑制作用，制霉菌素、灰黄霉素，对酵母、霉菌都有抑制作用，而不能抑制细菌和放线茵。芽孢杆菌的污染，常常给菌种培养带来极大的困难。为了抑制大多数芽孢杆菌的生长，不防碍霉菌的繁殖，需要在分离培养基中加入选择性的防腐剂。G.smith发现在培养基里加入玫瑰红(四氯、四碘萤光素）是非常有效的，其加入量是每升培养基加0.035克。在培养基灭菌后，可以不必加抗菌素。假如需要的话，玫瑰红在培养基里的浓度可以增加到每升0.067克，这个浓度可发挥显著的抗扩展作用，超过这个浓度，霉菌也要受到抑制。下面三个培养基可以作为分离霉菌抗细菌的培养基：

①Littman氏培养基(1947)，

葡萄糖 1.0％、蛋白胨 1.0％、牛胆汁 1.5％、结晶紫 1∶100，000、链霉素 30单位／毫升、水 l00毫升。

培养基先在不加链霉素时制成，用一般方法灭菌，冷却到50℃，用无菌生理盐水(0.85％)配成链霉素，在培养基倒入培养皿前加入。培养基中的牛胆汁可防止霉菌菌落扩张。

②G.smith氏培养基：

葡萄糖 10克、NaNO3 1克、K2HPO4 1克、琼脂 1.5克、玫瑰红 0.067克、20％土豆汁 1000毫升。

③Cooke氏培养基；

葡萄糖 10克、蛋白胨 10克、KH2PO4 1克、MgSO4"7H2O 0.5克、琼 脂 20克、玫瑰红 0.035克、水 1000毫升、金霉素 35微克。金霉素在培养基灭菌并冷却后，倒入培养皿前加入。

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