细胞实验经验讨论总结

gl19860312

在细胞实验室，有很多经验很难总结在书本上，但是与整个实验的成功却密切相关，现在建立新贴，想到哪里说道哪，随时补充并建议高手随时添加内容，大家共享自己实验中积累的小窍门。
1）细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。建议0.5-1ml之间即可。
2）许多教科书推荐细胞解冻用37度水，本人发现温度可以适当提高，39度也没有问题，虽然只提高了2度，却可以加速细胞解冻的时间。解冻后有提点挺重要，迅速用75%乙醇消毒冻存管管口和双手，然后进入下一步工作，随时别忘无菌操作。
3）当无菌操作台经常有多人工作时，记住自己用时，尽量把各种实验用物在紫外灯下消毒30-40分钟， 包括枪头，移液器，废液缸等容易忽略的物品。但是，不要让胰酶和培养液处在紫外灯照时下！
4）准备用实验台时，关掉紫外灯的同时，应打开鼓风机，如果操作太两边都有风机旋钮，应该保持两边风机风速一致，而且应该大于100，以免飞虫进入（当然不能吹灭酒精灯火苗）。最好再用75酒精蘸洁净一次性纸巾擦试所有可以消毒的地方，尤其是工作面。
5）如果不是通过两个圆孔进入手臂操作，而需要抬高操作台前置玻璃挡板，一般不要超过15厘米，主要目的还是减少污染几率。

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滨州柱子 发表于 2012-9-11 15:04
楼主真是辛苦！感谢！

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参考一：
我冻存细胞时还是用1.5ml的，具体操作时，我把冻存管直立起来放在-20的冰箱里，这样问题就解决了！
同时冻存细胞的时候，一定加上封口膜，这样可以避免复苏的时候，水浴箱里的水进入盖子的缝隙中！
参考二：
冻存细胞时我一般加1.2-1.5 ml，解冻温度设到40度，复苏效果很好
废液缸我们是用75%的酒精消毒后拿进去，各种试剂瓶拿进超净工作台时都要用75%酒精擦拭，支持楼上两位。
参考三：
我也做过一些细胞实验,感觉如果无菌操作不严格,很容易造成污染,导致实验失败,以下也有几条经验跟大家分享一下吧:
(1)做实验时保持白大褂的干净.尤其不是通过两个圆孔进入手臂操作的实验台,白大褂的干净整洁(尤其是袖口处)可直接影响到实验的染菌几率.并最好不要把袖子掳起直接进去操作,因为我们皮肤表面可能会有细菌滋生.
(2)保持实验台的干净整洁,尽量保持实验台上所放物品少一些,并且保持实验台里的东西是专台专用.
(3)初学者常常会将瓶口、瓶盖在火上烧灼的时间少一些来减少染菌的几率，其实这样往往会加大染菌的机会。正确的做法是在火上烧灼片刻后（外焰）立即盖上，并保持一定的通气量，水平放置。
参考四：
有关细胞冻存与复苏，我也总结两点：
1 冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。
2 水浴箱是个大问题，我们实验室有次细胞很严重的污染事件，哪里都没出问题，后来查了水浴箱中的水，发现了很多大肠杆菌。所以建议水浴箱一定要及时将脏水倒掉，然后用75％酒精擦洗箱内，最后换上蒸馏水。
3 水域温度我觉得39——40度比较好，因为以前我38度复苏时，一般一分钟内不能融化细胞，细胞存活率也不好，而40度时细胞的存活率满高。
4 还有就是提醒象我这样马虎的同学，细胞冻存在4度，或－20时就忘了，我干过好几次这样的事（这几次细胞种很好，很心疼），其实可以将冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。
总之，养细胞是件及其麻烦的事情，需要超级的细心与耐心，有一点是大家需要牢记的，你对细胞的态度，与细胞对你的态度是成正比的，你糊弄它，它就不会好好给你长，或者污染，或者死亡，在时间和金钱上给你带来损失。

gl19860312

参考五：
1.我觉得拿个烧杯盛蒸馏水加热到复苏温度然后放到水浴箱这样做就可以避免楼上的2问题了。
2。买个程序降温盒会较好的。
参考六：
怕袖口污染可以出去做一些布的袖套，高压灭菌，反复使用，便宜且效果好。
推荐蒸馏水40度复苏，有上述优点。
参考七：
1.在冻存细胞的时候加大血清的比例，到复苏的时候死的细胞数相对少， 如果有条件的话用全血清冻存效果更好
2.细胞室在使用前最好用福尔马林进行熏蒸一下，比较安全，每周至少用消 毒水去擦细胞室地面一次，
3.血清从-20度中取出后要进行缓慢化冻，否则容易形成沉淀，使用前最好离心会发现有沉淀物。
4.注意血清是否需要灭活
5配置细胞营养液的时候，PH一定要用酸度计测准确，而且有必要检测其渗透压
说的不好请大家多指教
参考八：
其实只要是生物安全柜的话，不用酒精灯也可以的。
参考九：
1,一般肿瘤细胞培养的血清可以不灭活。我们用没有什么问题
2，酒精灯基本没有多大的用处，以前园子里讨论过。但是大家都在用，那就用把，但是要注意速度要快，尤其是烧烤的时候不要碰到酒精灯的灯芯，因为这样会沾染烧焦的灰。有可能污染
3，细胞降温冻存的温度降低应该是每分钟1-2度，所以，可以先从室温放4度大概半个小时，再放-20 半个小时，然后放-70 一个小时，直接放液氮。这样比较好。我们也尝试直接放-70 保存，好像细胞也长的还行。
4。细胞一旦污染，首先看培养液是否浑浊，最好一旦谁的细胞有问题，整个实验室的人都可以去看看，大家都学习了，对于以后的实验也是个警示，同时以后遇到类似情况心中有个数，共同学习很重要。
5。 细胞瓶子，等所用的物品，最好自己全部准备，不要让别人代理，这样那里有问题，自己也知道，不然一旦细胞出了问题，找原因很困难。只能全部扔掉。可惜呀。
6。不同的细胞在培养是最好不要一起操作，应该一个弄完，开紫外。再弄下一个。不然有可能细胞交叉污染，形态变化。细胞不纯！
参考十：
生物安全柜我觉得它的风是往里吹的，如果有细菌的话可能吹进去不知道是不是可行。大多数的培养基都可以用于肝癌细胞，如IMDM.DMEM都可以的，血清添加10％，最好是灭活，保证营养液的PH,用胰蛋白酶消化时间不要太长，离心在1500左右就可以了，不要多于五分钟，时间长了也没有。

gl19860312

参考十一：
生物安全柜吹进去的风与玻璃墙后的风幕汇合进入底层循环，经高效滤网过滤后才继续在安全柜内循环，只要操作时不是很频繁的进出风幕，不会存在细菌被吹进去的可能
参考十二：
我在美国高级别的实验室看见他们细胞培养操作既不用酒精灯，也不用紫外线，也不换白大衣，但工作台的鼓风机永远不关，任何时候都往台面和手套上喷酒精，没有污染。
参考十三：
我有个小法子,挺好用.
复苏细胞时,选用一支PE手套,将冻存管塞到手套的指头里,这样就能避免污染了,而且不会影响温度.
参考十四：
1.我复苏细胞用42度，效果很好，因为刚解冻里面的细胞悬液达不到很高的温度，冻存管最好装80-90%满，血清含量尽量高，冻存管口要用封口膜2.DMSO分装，要放在阴冷地方，不要紫外照射。否则变成红棕色就没有用了，还对细胞有毒性，含量一般以5-10%为宜
3.细胞冻存最好保持均匀降温，可以包棉花放在-70度低温保存1个小时，然后慢慢放进液氮罐里面；还可以自己做一个梯度冷冻装置，找两个塑料盒子，小盒子可以套在大盒子里面的，两层之间加异丙醇，把样品放在里面，整个盒子放在-70度冰箱里面，1个半小时以后取出放液氮中，效果非常好
参考十五：
其实细胞复苏时，做一个漂子，把从液氮里刚取出的细胞冻存管插在上面，再放到40度左右的水里，一切问题都解决了。既可以快速溶化，也不会污染，可谓一举两得。
参考十六：
再提几个移液器的使用经验。
1）每次使用时注意使用体积应该用对应量程的移液器（枪）。如吸取10微升宜用1-10微升量程的移液器，这样获得液体量比较准确，注意，吸液推按至1档，排液推按至2档可以保证液体完全排除。
2）如果吸取乙醇等挥发性液体，尤其是小量程，吸液推按至2档，排液推按至1档，这样可以避免挥发损失，影响试验的精密度。
3）1毫升移液器满量程使用时，尤其注意，吸液时移液器与水平面的夹角宜大于80度或尽量保持直立，吸取时已缓缓进行，以免溶液污染移液器头部。
4）用移液器插取枪头时，不宜作上下运动，常此以往将会影响移液器使用寿命。稍微左旋或右旋即可插紧。
5）吸取溶液时，先将移液器调到大量程，然后回到需要量程，如需要15微升，先调到16微升再回调至15微升，这样调制的量程比较准确。
6）使用完移液器后，调回原最大量程，这样内部弹簧处于松弛状态，可以延长移液器使用寿命。
参考十七：
关于冻存时间，不是很好说，一般液氮可以保存1-2年左右不会出问题，这与冻存液配方有关，血清含量多，相对冻存时间长。-70度冰柜一般1-2个月问题不大。当然细胞不同，不可一概而论，还需在实际操作中摸索经验。
参考十八：
1）大家知道，细胞培养箱一般温度37度，5%二氧化碳保持细胞需要的酸碱度环境。其中孵箱底部的水盘有时被忽略了，一般底盘2周左右加一次蒸馏水，每次至少1升，以便保持孵箱的饱和湿度，以免培养基蒸发，丧失。
2）孵箱经常被打开，所以不是无菌环境，应注意尽量少打开孵箱，以免水分蒸发过快、污染或二氧化碳损失过多。
3）孵箱底盘的水很有可能霉菌污染，所以可以加1/1000以下的叠氮钠防霉菌。此外注意不要在孵箱开门的情况下说话。
4）一般孵箱有2-3层，最好同一层不要放不同的细胞。
5）有人有裸手抓培养瓶镜下观察的习惯，这很不好，至少应该用75%酒精擦拭手后再观察。

滨州柱子

楼主真是辛苦！感谢！

青莲618

不好意思，点错了，本来是要顶一个，点成了踩， 对不起，很好的帖子，谢谢

liushoujia

很有用，谢谢分享