【转】浅谈复方制剂的有关物质质量标准的建立

gl19860312

开此贴跟大家讨论一下复方制剂杂质的控制以及分析方法建立的一些相关问题。本人在分析实验室做了6-7年仿制药申报，负责药物CMC方面的质量研究工作，接触了十几个项目。基本了解FDA/SFDA审评人员的一些要求和想法。

此贴会结合本人的一些经验，探讨复方制剂有关物质分析的一些注意点，并且会结合产品申报以后FDA给的缺陷信，提示大家如何避免同样的问题。更希望抛砖引玉，各位版友和专家踊跃参与，共同提高。

废话少说，对于有关物质的研究，最近几年国家法规的要求越来越高，可能大家也越来越重视此项研究。不过一个不可否认的事实是，我们的杂质研究水平和欧美或者印度等国家差距很大。我们的绝大部分药品企业基本处于食物链的最底端，以前经常听我们老板说他在美国的药厂工作的时候，要从其他公司买API，很多都是西班牙的，意大利的，或者印度的药厂以极其低廉的价格从国内厂家购买的粗品，然后拿回去做一到两步的提纯，再做一些法规文件，就可以以很多倍的价格卖出去。我们消耗了主要的人力，物力，牺牲了环境，结果回报只有人家的零头，可悲又可气！所以我们就要具体的看一看到底存在哪些差距。

复方制剂有关物质控制的基本原则和单方一样，你就把他当作是在做两个或者三个产品，只不过是同时分析几个物质。相关的指导原则大家也应该都知道， ICH Q3A和Q3B; FDA也有相关的工业指南，跟这两个基本差不多。

做杂质研究和其他大部分质量研究工作一样，首先要做的第一步就是去收集资料，包括：
1． API厂家的技术资料，一般有DMF的会提供它的open part, 里面会大致列出它的工艺流程，合成路径和所有潜在的杂质。
2． 药典的各论，包括USP, EP等等，看看药典有那些要求检测的杂质。
3． 查阅文献，看看化合物的潜在杂质和降解产物。这一点对于制剂的杂质控制有时会提供很有用的信息。
4． 国内申报仿制药最好弄到进口注册标准，看看原研厂家是怎样控制杂质的。

收集完相关的资料后，下面就是分析方法的建立。杂质分析方法的建立又是一个巨大的topic，这里不细说，一个基本的原则就是你开发的方法要是可以用的并且用着比较舒服的，如果连方法开发的人自己都用的疙疙瘩瘩的，经常出问题，可想而知其他人用的会怎么样。
另外很重要的一点就是测定有关物质的方法必须具有稳定性指示功能（stability indicating）,这是在FDA deficiency letter里面最常见的一条关于分析方法的缺陷。含量测定和有关物质都有稳定性指示功能的要求，因此含量测定和有关物质测定方法一般采用相同的色谱条件，只是浓度有差别。评价方法是否具有稳定性指示功能的主要依据就是stress study (破坏实验)，关于这一点，本人会在后面单独论述。

杂质分析方法的建立，常见的方法有以下几种：
1． 直接用杂质外标法定量
这种方法最直接，精确。前提是你的杂质对照品充足而且来源可靠。

2．带校正因子的外标法。
一般按杂质的限度配置主成分对照品，计算各已知杂质的量时考虑校正因子即可，未知杂质校正因子按“1”算。90%的杂质分析都采用这种方法。

3. 面积归一化法
计算各杂质的面积百分比，这种方法如果单独作为杂质的检测方法申报，是基本不会被FDA接受的。

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下面谈一谈复方杂质限度标准的建立和最后结果的报道

这里可以给大家举个例子供参考，比如一个复方产品含有两个活性成A和B，规格分别是10 mg/5 mg. 标准如下：
Impurity RRT Limit (w/w)
A related compound 1 0.13 ≤0.10%
A related compound 2 0.22 ≤0.20%
A related compound 3 0.45 ≤0.10%
A related compound 4 1.57 ≤0.30%
… …
B related compound 1 0.34 ≤0.20%
B related compound 2 0.78 ≤0.10%
B related compound 3 0.26 ≤0.20%
B related compound 4 1.14 ≤0.40%
… … …
Individual unknown impurity / ≤0.20%
Total Impurity / ≤1.5%

需要注意的地方包括：
1． 制定各限度的基本原则是ICH Q3B和相关药典标准。但是最重要的依据就是你的加速和长期稳定性研究的数据。药典标准总是最低标准，满足药典标准并不代表OK。所以如果你的限度定的比稳定性结果大很多（比如限度是1.0%，测定只有0.1%），基本上肯定会被发缺陷信要求收紧。做仿制药的研究，RLD的impurity profile 也是一个重要的参考依据，需要关注。
2． 所有列在质量标准中的已知杂质一般只包括降解产物(degradation product), 无须包括中间体，合成工艺杂质等 in-process impurity. 如果要包括in-process impurity的话也可以，但其限度应该与原料限度一致，否则会被发补。
3． RRT（相对保留时间）是判定样品中各已知杂质的主要依据。A的有关物质就应该对应与A成分计算RRT, B有关物质对应于B算。对于未知杂质，对应哪个成分算都可以，但测试方法中应指明，并且在测试报告中标记清楚。
4． 未知杂质的计算对于复方产品可能稍有争议，因为你不知道它是哪个成分的降解物，所以不能确定用哪个成分当对照。我们的做法是用两个主成分的面积和当对照，当然对照的浓度也要加和，至少这种计算方法到目前为止审评人员没有疑义。
5． 所有的报道结果都是与你的检测方法不可分割的，所以抛开测试方法谈测试结果没有意义。如果你用的是药典方法，应该注明 (譬如：USP34)，如果是自己开发的方法，需要方法的内部编号以及版本。
6． 报道规范可能各个公司不一样，但应有SOP规定。比如小数位数，未检测到的杂质如何报道，检测到杂质但低于检测限或定量限如何报道等等。我看过很多国内出的检测报告，很少能把我说的上面说的两点做好的。有的甚至有关物质项直接就写“符合规定”，这种报告肯定会被内行人笑话的。还有的写“未检出”，但也不把检测限一起列出来，这种报道值也很不规范，希望大家注意

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下面再谈的一点是杂质分析方法的验证的一些注意事项，关于这一点大家也有过很多讨论，我只说几点容易忽视的地方。

1． 作为杂质分析方法的验证，因为你的研究对象是各个有关物质，所以要首先想办法搞到所有的指定杂质对照品，除非你用的是药典指定的方法。一般获得杂质对照品的途径包括API的供应商，各国药典对照品，各大试剂公司以及一些专门提供杂质对照品的公司。一般这些杂质对照品的价格都是很贵的。我记得我一次从EP买一个5-10 mg的标样花了接近1k欧元。所以很多时候搞GMP也就是要花钱。买了对照品记住一定要有CofA（要求提供结构鉴定，纯度，有效期等信息）。
2． 杂质分析方法验证的要求就是你把每一个杂质都当成含量测定来做，尤其需要注意的是方法的专属性。包括各个杂质以及主成分之间的分离度，溶剂的干扰，敷料的干扰，另外就是用破坏实验考察方法的专属性。分离度1.5是一个通常的要求，但是也并不绝对，只要你做过一些研究，包括改变流动相，选用其他品牌的柱子，发现并不能改善分离度，稍差一点的分离度通常也是可以接受的。
3． 杂质定量分析的最低限要从定量限开始，所以线性范围也是从定量限做到杂质限度的120%或更高，一般都是采用混合标样同时做各杂质的线形。这样也可以同时测定各杂质的定量限，相对保留时间(RRT)和相对响应因子（RRF）。检测限可以不做。
4． 方法学研究并不是为了验证而验证。其实通过方法验证，我们可以全面的了解分析方法可能存在的问题。比如：1方法回收率不合格, 延长超声时间会变好，这个就是明显的方法提取的问题。2. 在方法耐用性实验时，发现测试对柱温敏感，那就必须在方法中规定柱温。3.如果发现化合物的保留时间极易随流动相pH变化，就要控制此pH在合理的范围内等等。
5． 方法学验证不充分是FDA发布缺陷信的一个一直不断的问题。尤其对于杂质分析，其内容相比其他的项目要多，处理也比较复杂，值得大家花更多的时间关注。

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有部分内容我还有点疑问，希望与各位老师讨论一下。
（一）“2． 所有列在质量标准中的已知杂质一般只包括降解产物(degradation product), 无须包括中间体，合成工艺杂质等 in-process impurity. 如果要包括in-process impurity的话也可以，但其限度应该与原料限度一致，否则会被发补。”
在国内CDE要求现在的制剂中的工艺杂质也是需要控制的，虽然这和国外的要求不一样，但是我觉得也是可以理解的，因为国内有些厂家经常暗地变更原料药的供应商，而导致杂质谱发生变化，所以工艺杂质在很多情况下在制剂中也是需要控制的。而对于复方制剂而言，原料药的供应要求更要提高，因为根据相对保留时间来定已知工艺杂质的归属时需要杂质谱的稳定，否则会出现归属不明确的情况；
（二）“3． RRT（相对保留时间）是判定样品中各已知杂质的主要依据。A的有关物质就应该对应与A成分计算RRT, B有关物质对应于B算。对于未知杂质，对应哪个成分算都可以，但测试方法中应指明，并且在测试报告中标记清楚。”
我个人觉得在计算杂质RRT的时候，如果有关物质检查方法用的是同一个色谱条件的话，杂质RRT找其中某一个RT变化较稳定的成分来计算也是可以的，这样能比较直观地观察出不同组分杂质间的出峰和分离情况，在我遇到的进口注册标准中有不少原研公司都是使用这种计算方法的；
（三）“未知杂质的计算对于复方产品可能稍有争议，因为你不知道它是哪个成分的降解物，所以不能确定用哪个成分当对照。我们的做法是用两个主成分的面积和当对照，当然对照的浓度也要加和，至少这种计算方法到目前为止审评人员没有疑义。”
在杂质不能确定归属的时候，我认为应该为确保限度的安全性，未确定归属的杂质应该归属于复方中规格较小的组分，按小规格组分来制定限度。一般的杂质在做了充分的研究后，一般还是能确定归属的。
（四）在研究复方杂质归属的时候，有条件的公司可以试试按复方中各单方的规格按同种工艺压制各自的单方制剂，这样的话更容易明确杂质的归属的。
希望与各位老师多多讨论，共同解决复方杂质研究这个共同的难题。

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ICH Q3B写的很清楚：“Generally, impurities present in the new drug substance need not be monitored or specified in the new drug product unless they are also degradation products。”
工艺杂质是不需要在制剂中控制的，除非它也是降解产物。这也是FDA的要求，我们发过几次deficiency都提到这一点。
至于你提到的“厂家经常暗地变更原料药的供应商”的情况，这是严重的cGMP variation, 如果被FDA抓到，肯定会发warning letter, 这个药厂也就差不过game over了。这也是国内监管不严的差距之一。

杂质RRT的计算，不是一个原则问题。作为一个成熟的方法，每一个组分的保留时间应该都很稳定，理论上用哪个计算都可以，习惯问题，说清楚就行。

至于未知杂质的计算，我刚进实验室的时候也是和你同样的观点，会觉得按较小的组分计算别人不就提不出什么问题了吗。这个涉及到药厂自身的利益，欧美药厂也一样，要在法规允许的前提下最大限度的争取自己的利益，很有可能出现的一种情况是原来按两个加和计算合格的产品，如果按小的计算就不合格。Science和regulatory有时并不和谐统一。我这里说的case都是FDA可以接受的以供大家参考。

对于复方制剂来说，大部分的杂质是不需要做identification的，Identification限度是多少ICH Q3B规定的很清楚，小于这个限度我不需要鉴定，也不需要判定归属。

你说的“复方中各单方的规格按同种工艺压制各自的单方制剂”做研究，我所了解的北美generic company没有这样做的。如果FDA要求这么做的话，以后一个复方仿制药的批准周期可能要延长到5-10年。

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下面再来谈谈怎么做破坏实验（stress study/forced degradation study），相关的讨论很多，文献也很多, FDA的审评专家在最近也发表了文章阐述了最新的要求和看法。

如果读透这篇文章，我觉得基本上90%的问题应该解决。我也只是总结以下可能会遇到的一些问题。

? 为什么要做破坏实验？要解决哪些问题，获取那些信息？
了解产品的固有稳定性，获得各种强制条件下所产生的降解产物信息及可能的降解途径，为制剂工艺筛选提供依据。现在比较时髦的叫法-Quality by Design (QbD).
可以为产品选择合理的包装材料及容器，确定初步的储存条件。
预测药物的杂质谱及主要降解产物，为加速及长期稳定性研究提供依据。
确证方法中的含量测定及有关物质的检测方法是具有稳定性指示功能的。
为质量标准的制定提供依据.

? 怎么做破坏实验？要做那些条件，具体如何操作？
一般的破坏条件及降解途径主要有四种，包括：
1． 高温 （譬如50， 60 ，70℃）条件下加热一段时间（如5，10天）
2． 光照 （包括白光和紫外光）
按照ICH Q1B的要求，白光要照够1.2E6 lux hrs, 紫外光要200 watt hrs
3． 水解 （酸解，碱解）
酸碱的浓度一般控制在0.1-1 M, 可以加热（比如85度回流），也可以常温（2星期）进行，以得到适当的降解产物为目的。
4． 氧化
最常用的是双氧水，浓度在0.1%-3%左右，可以加热（比如85度回流），也可以常温（1星期）进行，也是以得到适当的降解产物为目的。
我接触的都是固体制剂，我觉得其他剂型也应该基本类似。

? 多少的降解量是恰当的？
很多文献建议10-30%，FDA推荐的程度是5-20%。总之10%左右是比较理想的。并且不需要每个条件都达到，一般一个就够了。关于这一点，下列情况可能会被发补：
1．如果药物在所以的破坏条件下都不降解，会被要求加剧破坏条件，如果仍不降解，要求提供合理的解释
2．如果降解程度过大，会被要求采用缓和的破坏条件重复实验。

如何设计实验及分析那些样品？
特别要关注的是这一点，也是比较容易出问题的，尤其对于复方产品。
1． 应该需要平行做一份未破坏的样品作为对照，为了保证取样的均匀度和消除制剂个体之间的差异。一般可以一次取足够量的样品，将其充分研磨均匀，然后平行操作，分别从中取做破坏实验和未破坏研究。
2． 对于制剂，应该做每个破坏及未破坏条件下的空白敷料（placebo）对照。
3． 复方产品的每一个活性成分应该分别平行做破坏及未破坏研究。
4． 酸碱及氧化条件下的空白试剂对照也应该平行做。

这样的实验设计才是比较合理的，通过这样的研究，我们可以很容易的看出，哪些色谱峰是drug related 的降解产物，哪些来源于溶剂空白和敷料，并且可以知道杂质色谱峰是归属于复方产品的哪个主成分的。这样对于我们的加速及长期稳定性研究提供了很有益的预测帮助，可以排除各种敷料峰的干扰。

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单独开一贴讨论破坏试验中物料平衡（mass balance）的问题。

这也是现在FDA对破坏试验发补比较多的地方。

先看看mass balance的定义：ICH Q1A “The process of adding together the assay value and levels of degradation products to see how closely these add up to 100% of the initial value, with due consideration of the margin of analytical error.”
简单的说就是把初始样品（未破坏样品）的含量当成100%，计算破坏试验样品的含量加上降解产物的量距离此100%有多远。园子里很多人在问mass balance怎么计算，这就是计算方法。

接下来一个问题, Mass balance达到多少才算合格？

我跟很多人请教过这个问题，暂时没有一个官方的答案。一般认为如果达到95%以上就是可以接受的，但是这也要求药品要有一定的降解（>10%）；如果你的主成分降了5%，降解产物只检测到0.1%，那肯定也不行。

如果mass balance不合格，有可能是那些原因引起的？

如果出现物料不平衡的情况，FDA通常会要求你做出恰当地调查和解释，通常可以从以下一些方面来考虑。
1. UV检测器对主成分和杂质的不同响应引起的。这种情况最常见。
2. 有挥发性的杂质生成
3. 生成的杂质没有响应
4. 生成的杂质很早就和溶剂峰一起流出。（3,4两点经常在氧化降解的时候发生）
5. 降解产物残留在柱子上未被洗脱。

知道了这些可能引起物料不平衡原因，我们就可以对症下药。包括采用DAD检测器，或则其他类型的检测器辅助（ELSD, MSD）；采用梯度洗脱的HPLC的方法等等。另外值得注意的就是：通常来说降解程度越高，物料平衡越难达到，所以当mass balance有问题的时候一般把降解量控制在5-10%来研究。还有就是永远不要忽略一些不起眼的小峰，把所有高于检测限的峰都积分出来可以帮你解决一些mass balance的问题。

这里就顺便谈一谈有关物质如何选择检测波长的问题，其实也跟mass balance有关。因为95%以上的测定都是用紫外检测器，这里只谈紫外的波长选择，并且一般需要DAD检测器。

1. 一般含量测定和有关物质采用相同的色谱方法，含量测定的检测波长一般采用最大吸收波长，方便起见有关物质的波长也采用最大吸收。但是这样做的前提是大部分的未知降解产物（已知的已考虑校正因子，无影响）的紫外吸收曲线与主成分一致。
2. 如果大部分的未知降解产物的紫外吸收曲线与主成分不一致，导致破坏试验的物料不平衡，那么就要考虑调整吸收波长，已使得降解产物可以被合理的检测出来。
3. 如果各个降解产物本身紫外吸收差异较大，波长无法统一选择的话，可以考虑用双波长甚至三波长同时检测。
4. 对于复方制剂，考虑到杂质较多，情况比较复杂，所以一般会选择较低的波段（<=220 nm） 作为检测波长，因为大部分杂质在此处都会有吸收，如果需要可采用双波长。此时要注意流动相的末端吸收。

特别要注意避免的一种情况是，选择的测定波长对于主成分来说在它紫外吸收曲线的陡坡上，而此波长对于杂质来说正好有与主成分相反的趋势，这样会导致检测器发生微小的波长变动就会使测定结果相差很远

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经过一段时间的学习，参考大家的评论和资料，准备进行以下内容的有关物质的研究，同时又产生了新的疑问，请指正。

以下实验方案：

外用化药仿制药、假设根据剂量，报告限度为0.1%，鉴定限度为0.2%，质控限度为0.3%

1、专属性：

破坏试验：

制剂、空白制剂在强酸、强碱、高温、光照、氧化条件下破坏至有1到2种达到5-10%（通过破坏前后峰面积比较），排除溶剂峰、辅料峰、辅料破坏后产生的峰后剩余的峰即为有关物质峰。确认分离度大于1.5。（此处有疑问，是否低于破坏前主成分峰面积0.1%有关物质峰即可忽略？否则报告限度0.1%如何理解？）

物料平衡：

破坏后主成分加有关物质峰面积应在破坏前主成分峰面积的95%-105%（对已知杂质此时是否需要先测定校正因子？校正因子在什么时候测试合适？）

峰纯度检查AD（如果物料平衡正常，是否不需要进行主峰纯度检查）

2、定量限：

10倍于噪音信号强度的杂质对照品溶液，重复进样6次，峰面积RSD不大于10%，保留时间RSD不大于2%（还是直接配成报告限度浓度的溶液，进样6次。同上，报告限度0.1%如何理解）

3、检测限：

3倍噪音信号强度的杂质对照品溶液。（是否需要重复进样并计算RSD）

4、线性：

取杂质对照品配成从定量限到质控限度120%的6个不同浓度溶液，计算。要求相关系数不小于0.990（此处有资料要求，Y轴截距在100%响应值的25%以内，响应因子RSD不大于10%。这两点如何理解？）

5、准确度：

在空白制剂溶液中加入杂质对照品，配成0.24%、0.3%、0.36%（质控限度0.3%，取80%、100%、120%浓度。还是取50%、100%、150%更好？同时线性做到质控限度的150%），计算回收率。要求回收率80%-120%，RSD不大于10%

6、精密度

重复性：配置6份浓度为0.3%（质控浓度）的杂志对照品溶液，同一人在相同条件下测试。RSD不大于15%

中间精密度：上述溶液两人在两台设备商测试。RSD不大于20%

7、耐用性：

分别考察流动相比例变化±5%ph值变化±0.2柱温±5℃检测波长变化±5nm，流速变化±20%及三根不同批号的色谱柱进行测定。各测定两次，分离度应大于1.5，杂质含量RSD不大于5%。使用空白制剂加入质控限度（0.3%）的杂质对照品的溶液进行测定。

8、溶液稳定性

取供试品溶液，室温放置，分别与0、1、2、4、6、8、12、24h进样，计算主要杂质及总杂质含量，杂质含量变化±0.1%以内。