[转帖]固定化酶法生产5'—复合单核苷酸

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固定化酶法生产5’—复合单核苷酸
: S2 z4 _9 [; C9 G) l0 }$ W5’—复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备磷酸酶。

工艺路线：
1、磷酸二脂酶的制备 取干麦芽根，加9-10倍体积的水，用2摩尔每升的盐酸调酸度至5.2，于30度条件下浸泡15-20小时，然后加压去渣，浸出液过滤，滤液冷却至5度，加入2.5倍体积的5度95%冷工业酒精，5度静置2-3小时后，吸去上层清夜，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗涤2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，备用。
2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸铵溶液溶解，过滤得到酶液。另取湿ABXE-纤维素40公斤，加入0-5度蒸馏水至80升，搅拌下先后加入1摩尔每升盐酸和5%亚硝酸钠溶液各10升，搅拌均匀，于0-5度下反应，150分，抽滤，滤饼迅速用预冷的0.05摩尔每升盐酸和蒸馏水各洗3次，抽干后，将滤饼投入上述磷酸二脂酶溶液中，搅拌均匀后用1摩尔每升碳酸钠溶液调pH8.0，搅拌反应30分，用冷水洗3-4次，抽干，得到固定化磷酸二脂酶，备用。
/ x! o) N. T# h3、转化反应 取2公斤核酸，缓慢假如预热至60-70度的360升、pH5.00.001摩尔每升氯化锌溶液中，用摩尔每升氢氧化钠溶液调至pH5.0-5.5，滤除沉淀，将清液升温至70度，加入上述湿的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度维持pH5.0-5.5，搅拌反应1-2小时，根据增色效应，用紫外吸收法判断转化平衡点，转化完成后，滤出转化液，用于分离5’—单核苷酸，固定化酶再继续用于下一批转化反应。
4、5’—复合单核苷酸的分离纯化 将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3，滤除沉淀，，滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7，进入已处理好的氯-型阴离子交换树脂柱，流速为2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去离子水洗涤柱床，然后用3%氯化钠溶液以1-1.2升每分流速洗脱，当流出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。
5、精制及灌封 上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热源水稀释至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%药用活性炭，煮沸10分，脱色和除热源，滤除活性炭，滤液经除6号菌漏斗或0.45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5’—复合单核苷酸。