请教构建载体方面的问题!

lwangd8

站在云端(649704707) 16:29:17
构建载体方面的问题想请教

Episome(41617547) 16:39:10
啥子问题？
站在云端(649704707) 16:39:57
载体构建一直不成功
想学学
站在云端(649704707) 16:40:10
自己不清楚问题出哪了
Episome(41617547) 16:40:55
说具体一点
Episome(41617547) 16:41:55
构建什么类型的载体？

lwangd8

站在云端(649704707) 16:42:00
我用PGL3-basic构建载体
将目的基因与载体连接
Episome(41617547) 16:42:36
作promoter的
很简单啊
站在云端(649704707) 16:42:37
总是连接后转化感受态细胞
平板上什么都不长
Episome(41617547) 16:42:44
不会啊
站在云端(649704707) 16:42:53
恩 是的
但是我以前没有做过
新手
Episome(41617547) 16:43:07
你用哪两种酶切的？
站在云端(649704707) 16:43:16
做过很多次了
站在云端(649704707) 16:43:52
SmaI saci
Episome(41617547) 16:44:27
你是PCR产物酶切还是连接到T载体？
站在云端(649704707) 16:44:50
连接到T载体的
站在云端(649704707) 16:45:22
后来PCR产物 电泳胶回收
也连接过 什么都不长
站在云端(649704707) 16:45:42
请问是否连接到T载体 差异大吗？
站在云端(649704707) 16:45:51
会直接影响连接效果吗？

Episome(41617547) 16:46:02
不大
Episome(41617547) 16:46:16
用NEB还是宝生物还是精美的酶？
站在云端(649704707) 16:46:22
宝生物的
Episome(41617547) 16:46:45
确定双酶切没问题吧
站在云端(649704707) 16:46:52
恩 酶切没有问题
站在云端(649704707) 16:47:22
目的片段从T载体上双酶切后
电泳明显看到两条条带
Episome(41617547) 16:47:53
你选的一个是平齐一个粘性
站在云端(649704707) 16:48:03
恩 是的
只是PGL3 两个酶切位点之间
站在云端(649704707) 16:48:21
碱基数比较少
电泳检测不出来
站在云端(649704707) 16:48:43
但是转化感受态细胞后 什么都没有长
也说明 酶切完全了
Episome(41617547) 16:49:22
哦
那不一定
如果只有一个酶切了呢？而另一个没作用
Episome(41617547) 16:49:54
你这两个酶反应温度差异很大啊
Episome(41617547) 16:51:19
如果双酶切完全
一个平齐一个粘性，连接的时候温度可以选择4度和16度结合

lwdfjw

Episome(41617547) 16:56:09
我以前用的是mlu1和xho1


站在云端(649704707) 17:06:37
是的 酶切的时候反应体系不一样
温度不一样 但是在TARAKA上有双酶切的反应体系
而且温度我选的37 也没有问题