纤维素酶DNS酶活力测定方法

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1 定义
1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理
纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液
3.1  1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）
3.2  羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。取滤液100ml， 20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）  
4仪器和设备
4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)
4.2分光光度计
含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤
5.1 标准曲线绘制
    分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
5.2待测酶液的制备（同β－葡聚糖酶酶活测定）
5.3 比色测定
精确吸取经待测稀释酶液0.5ml，40℃预热5min，加入经40℃预热的CMC液1.5ml（每个样品同时作3支平行试管），于40℃水浴精确反应10min，立即加入DNS试剂3.0ml终止反应，以后按标准曲线制作步骤测定样品吸光度。
同时进行空白对照测定，取稀释酶液0.5ml，先加入DNS试剂3.0ml，再加入CMC液1.5ml，其余步骤同于样品测定。
6.计算
X=cn/(0.5*10)
式中：X－样品的酶活力，u/g；
      c－由样品的平均吸光度从标准曲线或回归方程求得的相对应的葡萄糖的量，mg；
      n－样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；
0.5－参与反应的酶液量，ml；
  10—反应时间，min。

空白对照液的配制：
(1)精确加入0.2ml稀释酶液。 (2)精确加入1.8 ml pH = 4.8醋酸缓冲溶液。
(3)放入新华1号滤纸一条。
(4)精确加入3ml DNS试剂。
(5)随同对照样，放入沸水浴中反应15min(注意：参见操作步骤6)。
(6)冷却后加入蒸馏水定容到25ml。
9．以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
滤纸酶活力 = A × 5 × 200 × 1000 / 60 （u/g）
A 吸光度值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）。

　
CMC酶（Cx）活力测定方法

用pH = 4.8醋酸缓冲溶液配制1%CMC溶液。
准确称取1g酶粉，用蒸馏水定容到2000ml，配制0.5g/L的稀释酶溶液。
在有标准刻度线的试管中加入1.8ml1%CMC溶液。
再加入0.2ml稀释酶液。
在50±1℃水浴中保温反应30min后，立即加入3ml DNS试剂。
空白对照液用1.8ml1%CMC溶液加入3ml DNS试剂，再加入0.2ml稀释酶液。
同时在沸水浴中反应10min，加入蒸馏水定容到25ml。
以空白对照液调零点，在λmax = 550nm下，用分光光度计测量吸光度值。
          Cx酶活力 = A × 5 × 2000 × 1000 / 30（u/g）