细胞培养污染的鉴别

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（一）细菌，真菌污染的检测
1.细菌，真菌污染常在传代，换液，加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48Hm可明显观察到。如培养基变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。
2.镜下观察
在倒置显微镜的高倍镜下可见培养基中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状，管状，树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
3.接种观察
采用普通肉汤接种或用未加双抗的培养基接种，也可发现是否有污染。
（二）支原体显微镜观察
1.相差显微镜观察
将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物（一般用长形盖片）上，24h后用清洁尖镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养基滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
2.地衣红染色观察
①取已培养瓶中的支持物盖片或培养基，用新鲜配制的0.5%枸橼酸溶液处理盖片细胞。
②用新配制的Carnoy液固定2次，每次10min，取出盖片凉干。
③用培养基时，先吸取1ml,500～800r/min离心5mIn后去除上清，留0.2ml,将0.5%枸橼酸溶液加入其中，置10MIN,加入Carnoy液固定。
④离心，弃上清，余0.2ML沉淀物，制成2～3张涂片。
⑤然后用2%醋酸地衣红（地衣红2g，冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml）染5min.
⑥纯酒精过3次，每次1min，封入Euparal或橡胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。
⑦镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞与细胞之间。
3.荧光染色法观察
用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。
①用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出盖片，于碟皿中。
②用不含酚红的Hanks液漂洗，1：3醋酸钾固定10min。
③用生理盐水漂洗后置于50ug/ml的Hoechst33258（生理盐水配制）中染色10min。
④置于蒸馏水中漂洗1～2min，向细胞面滴加数滴PH5.5的磷酸盐缓冲液。
⑤置荧光显微镜下观察。
若用细胞培养基，先离心去除上清，再加入Hanks液漂洗，记心弃上清后加入1：3醋酸甲醇固定10min，再用生理盐水漂洗后去上清，再用Hoechst33258染色10min，加入蒸馏水漂洗，离心去上清，加3～5滴PH5.5的磷酸盐缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。
4.电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72H,细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定，包埋，切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。
5.培养检测
①将2.5×109个/L细胞悬液5ml加入45ml支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养基有无雾状沉淀。
②然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养。
③37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

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黑胶虫污染的话如何鉴别呢？？