获得高质量土壤RNA的10个建议

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早期的文章介绍了如何提取土壤DNA。大篇幅详细讲解了影响DNA得率和纯度的研磨均质 、化学试剂 （重点是裂解缓冲液）等问题。做DNA远没有做RNA压力大。不用太担心降解，得率还挺高。RNA就不一样，提取土壤RNA是环境分子生物学研究最难的研究方法之一。RNA提取本身就是件艰巨的任务，提取土壤的RNA挑战更大。最大的困难之一是土壤RNA得率。从土壤中获得RNA远比DNA少，前者仅有后者的10-20%，所以需要比提DNA更多的加样量。因此需要用更大的研磨管（15ml）和更大的离心机。另一个大问题是腐植酸等抑制因子的污染。RNA实验对纯度要求很高，当逆转录寻找低拷贝数基因时，无法稀释RNA样品。要求加入反应体系中的RNA浓度足够高且不能含有抑制因子。

提取土壤RNA需要特殊条件
因此，MO BIO开发出了一套不使用二氧化硅离心柱的方法来提取土壤RNA。下面讨论关于RNA PowerSoil Kit以及何如获得更好的提取效果。这套操作流程包含了多种方法。IRT技术去除抑制因子，酚氯仿法最充分地裂解微生物细胞，阴离子交换技术更高的纯化质量。最终获得非常干净的RNA最大化地满足RT-PCR的需要。每个土壤样品质地、水分含量、微生物丰度都不一样，在提取过程中出现的状况不尽相同。下面重点讨论几个容易出错的关键步骤，以及做哪些修改可以获得更好的提取效果。

1. 样品起始量
对于绝大多数类型土壤，2g土壤是最大的样品起始量。然而，对于底泥这类含水量较高的土壤，本身实际土壤含量较低，微生物含量也不高，我最多用到5g的起始量。如果样品加入到研磨珠套管后，发现上面有一层水。最好先离心并吸去多余的水分。

2. 酚氯仿异戊醇Phenol: Chloroform（步骤5）
使用正确的PCI非常重要，在试剂盒操作说明书中我们给出了一些使用建议。PCI比例必须为25：24:1，pH介于6.7-8，并保存在pH8.0的TE缓冲液中。许多人提取动物组织和细胞习惯性地只使用地pH值的苯酚来提取RNA。而对于土壤，pH中性的苯酚会合适。

3. 优化异丙醇浓缩（步骤12）
PCI裂解步骤后加入SR3溶液，下一步加入异丙醇沉淀总核酸。如果你在做底泥，加完SR3溶液后总体积可能超过5ml。增加SR4（异丙醇）的使用量，至与步骤11获得的样品体积相同，以保证充分沉淀核酸。

4. 异丙醇沉淀的环境温度（步骤12）
标准操作说明建议-20℃冷冻样品。盐浓度高的样品核酸沉淀步骤请在室温下进行。冷冻样品沉淀的盐分，会改变阴离子交换离心柱上的核酸吸附绑定条件。你可以从沉淀物中看出来是否有盐分沉淀。正常的RNA沉淀表面平坦有光泽，若沉淀明显较大且表面有壳，表明有盐分沉积。底泥样品水分大，就算是淡水湖也好，多余的水分会含盐。

暂停点：有人曾经把步骤12的孵育时间延长超过30min，甚至过夜，最终RNA依然完好。不建议每个样品都延长孵育时间，至少土样样品需要测试才能知道是否影响RNA质量。只在特殊情况下，可以稍微在此步骤暂停。

5. 阴离子交换离心柱溶液自然滴下（步骤15）
最后的RNA回收步骤使用的离心柱装有树脂，溶液利用重力通过离心柱。有时溶液通过树脂的速度很慢，可适当施加正压加速流动。通常我们的做法是用5ml注射器针管缓缓加压，但流速不应该超过1滴每秒。

6. 摇、摇，摇匀SR5和SR6（步骤15）
SR5和SR6使用前必须充分摇匀。有些含有异丙醇的溶液静置会分层，使用前只要充分摇匀即可。

7. 节省洗提时间小提示（步骤19-20）
有时候直接洗脱到2ml Collection Tube，而不用15ml Tube。确保离心柱垂直放置不会倾覆。只有摸透了技巧才好这么弄，谢绝新手。

8. 最后异丙醇沉淀（步骤20）：Final isopropanol precipitation (step 20)
从离心管中洗脱下来以后，加入异丙醇（SR4溶液）做最终沉淀。需要在-20℃孵育。此步必须在-20℃孵育（VS 室温）。此步可适当延长时间。

暂停点：若提取工作没办法继续完成，可在此步暂停过夜。样品在-20℃冷冻，RNA能稳定保存。

9. 沉淀RNA（步骤22）
离心异丙醇分离RNA，正常RNA沉淀应小而呈玻璃光泽。离心时所有的Tube管要朝向一致，以便于倒出异丙醇时迅速辨认RNA沉淀。晾干RNA沉淀步骤需要快速完成。通常我们的做法是在超净台中把Tube管倒置在吸水纸上。

10. 重悬RNA（步骤23）
现在，有了漂亮的干燥沉淀。根据逆转录对体积的要求，重悬RNA。在实验室里头，若样品土壤微生物非常丰富，用50-100μl水重悬（通常最终浓度为100-20ng/μl）。底泥或干燥土壤微生物含量低，为了提高最终RNA浓度，用25μl水重悬。这一步可操作性很高，请根据需要加入适合的水量重悬沉淀。

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额外提示：
用SR6溶液洗脱RNA以后，离心柱滤膜还有DNA在。你可以用含有高浓度盐的SR8溶液（DNA Elution Accessory Kit 组分）把基因组DNA洗脱下来。因为整个核酸提取过程动作相对温和，可以获得更大分子量的DNA。阴离子交换离心柱的又一优势在于，可以从同一个样品中先后提取到RNA和DNA。

再一个额外提示：RNA稳定性和土样保存
关于采样后土样中RNA的稳定性，以及RNALater的使用。事实上RNALater并不兼容土壤。用RNALater在不同温度和时间下对土壤RNA的保护试验，结果发现随着保存时间的延长，RNALater会令土样释放出更多的腐植酸，粘附在RNA上与RNA共同吸附于阴离子交换离心柱滤膜上难以去除。保存的时间越长，样品颜色变得越深。

采样时使用LifeGuard Soil Preservation Solution 对土壤RNA进行保护，并且在运输过程中能保证微生物结构稳定不变。

总结：Summary
最具挑战性的样品提取就是土壤RNA。样品中RNA非常不稳定、含量很低，而且存在大量抑制因子和微生物源RNase。但是获得高得率干净RNA还是可以做到的。